1株卵形鲳鲹病原菌的分离、鉴定及其药敏试验

丁泽昊，赵子晨，李桂华，郭伟良，3，张冬冬，周永灿

（1.海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228；2.海南大学海洋学院，海南 海口 570228；3.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223）

卵形鲳鲹（Trachinotusovatus）俗称短鳍鲳、金鲳等，属于鲹科（Carangidae），鲳鲹属（Trachinotus），为中上层洄游暖水性海水鱼类.其肉无刺，并且肉质细嫩，味道鲜美，生长速度快，海南从20世纪90年代初就已经开展了卵形鲳鲹海水网箱养殖［1］，现在卵形鲳鲹已成为海南、广东、广西和福建等地区深水网箱养殖的主要品种之一，并且在海南已发展为当前单一养殖产量最高的海水养殖鱼类［2］，据统计，2016年海南省金鲳鱼的产量达到5万t，产值达10亿元以上.但随着养殖规模的不断扩大，养殖密度的不断提高以及近海养殖环境的衰退等诸多原因［3］，卵形鲳鲹的病害日趋严重［2-5］.刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）病、诺卡氏菌（Nocardia seriolae）病、美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae）病和链球菌（Streptococcussp.）病等都对其养殖造成了严重的危害.海豚链球菌（Streptococcusiniae）属于链球菌科（Streptococcidae），链球菌属（Streptococcus），它是一种常见的世界性分布的条件致病病原［6-7］，其主要感染温水鱼类.其中，卵形鲳鲹即为海豚链球菌易感鱼类，广东和广西等地均有卵形鲳鲹感染海豚链球菌的报道［8-11］.海豚链球菌可通过鱼体受伤部位以及消化道进入其血液循环系统，亦可突破其血脑屏障进入脑部，破坏脑神经，从而导致脑部充血或出血，致使宿主出现异常的螺旋状旋转游泳，在水面做头向上或者尾向上的转圈游动等症状；此外，海豚链球菌还可以通过血液循环破坏卵形鲳鲹的肝、肾、脾等器官，引发其全身性出血，并伴随肠道积水而引起的腹水症状［12-16］.2020年7月，在海南临高县桥头镇发现卵形鲳鲹的养殖网箱内出现了疑似海豚链球菌感染症状的疾病，为弄清卵形鲳鲹的致病原因，本研究采集了患病卵形鲳鲹的鱼样本，并对其进行了病原菌的分离、鉴定及药敏试验，旨在为该疾病的防控提供依据.

1 材料与方法

1.1实验材料患病卵形鲳鲹于2020年7月采集自海南临高县桥头镇的卵形鲳鲹养殖网箱，鱼体重为（65±15）g；试验用鱼购于海南临高县某卵形鲳鲹养殖场，体重为（30±10）g，暂养于循环水族箱（300 L）28d，养殖水温、pH、盐度和透明度分别维持在（30.0±1.0）°C、（8.1±0.3）、（30±0.4）和0.75 m，持续充氧，每天换1/3体积的水.

1.2病原的分离与纯化检查濒临死亡的卵形鲳鲹的外部症状并进行拍照和记录，用100μL/L丁香酚将鱼麻醉后，用酒精（φ=75%）棉球擦拭病鱼体表，于超净工作台打开病鱼腹部，检查病鱼的肝脏、脾脏和肾脏，从中取样并分别接种于硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂培养基（北京路桥生物有限公司）和脑心浸液肉汤（BHI）培养基（青岛日水生物有限公司）上，于30°C倒置培养48 h，观察各分离菌株的菌落形态并计数，挑取形态大小一致的优势菌落，进一步划线于新配制的以上两种琼脂培养基，30°C纯化培养48 h，于4°C保存备用.

1.3分离菌的人工感染试验将分离的优势菌株接种于相应的培养基上，30°C倒置培养36 h，接着用φ=0.7%的无菌生理盐水冲洗菌苔，制成菌悬液，然后以麦氏比浊法调整菌液稠密度至1×109CFU/mL.将40尾暂养28 d的卵形鲳鲹［体重为（60±10）g］随机分至4个水族箱（300 L），每个水族箱10尾鱼，每2个水族箱一组，分别为对照组和人工感染组，人工感染组的每尾鱼腹腔注射0.1 mL菌悬液，对照组的鱼则注射相同体积的无菌生理盐水.实验期间保持24 h持续充氧，每日观察鱼的症状与死亡数量，连续观察72 h，并将发病鱼按1.2的方法进行病原菌分离.

1.4病原菌对卵形鲳鲹半致死浓度（LC50）的测定将1.3中获得的致病菌株用φ=0.7%的无菌生理盐水制成菌悬液，用麦氏比浊法测其稠密度，然后用φ=0.7%的无菌生理盐水分别梯度稀释至1×108、1×107、1×106、1×105和1×104CFU/mL，制成菌悬液样品，接着将100尾暂养14 d的卵形鲳鲹随机分至10个水族箱（300 L），每2个水族箱为一组，共五组.每尾鱼以腹腔注射的方式注射0.1 mL以上制备的不同稠密度的菌悬液，对照组则注射无菌生理盐水.每日记录鱼的症状与死亡数量，连续观察14 d.

1.5病原菌的鉴定

1.5.1病原菌菌落的形态观察将1.3中所分离的病原菌划线于羊血平板（广东环凯微生物科技有限公司）上，于30°C倒置培养36 h，观察其菌落形态和溶血圈.

1.5.216SrRNA基因序列分析取对数生长期的新鲜菌液，利用细菌基因组试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取所分离的病原菌DNA.以细菌16SrRNA基因的通用引物（上游引物：5′⁃AGAGTTT⁃GATCCTGGCTCAG⁃3′；下游引物：5′⁃TACGGCTACCTTGTTACGAC⁃3′）作为引物，以1μL DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应条件如下：94°C 3 min；94°C 3 min，55°C 1 min，72°C 1 min，30个循环；72°C 5 min.PCR产物在ω=1%的琼脂糖凝胶于180 V电泳15 min，用回收试剂盒（Biomed公司）切胶回收目标条带，回收产物送至华大基因公司测序.将测序所得序列在GenBank中进行Blast分析，然后利用Mega 7.0.26软件对与该序列相关性较高的核酸序列进行序列比对，并进行系统发育树的构建.

1.5.3生理生化鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定学手册》（第8版）的标准进行鉴定.

1.6药敏实验采用K⁃B纸片琼脂扩散法对所分离的病原菌进行30种抗生素（杭州微生物试剂有限公司）的药敏试验.对于经30°C纯化培养36 h的病原菌菌液，用比浊法和稀释涂布平板法测定其稠密度，并使菌液稠密度为1×107CFU/mL，在30°C孵育24 h后，测量细菌在BHI平板上的抑菌圈直径，以确定其对药物的敏感情况：敏感性（S）、中等敏感性（I）和耐药性（R）.

2 结 果

2.1自然发病的卵形鲳鲹的临床症状患病卵形鲳鲹的主要症状为：体色变黑，鳍基、肛门或身躯出血（图1-A、图1-B）；并且鳃部呈现出明显的出血和充血（图1-C）.解剖后的器官病变包括：脾脏和肝脏肿大并有出血；胆囊肿大，腹腔积水（图1-D、图1-E）；肠道内有积水或黄色粘液（图1-E）.

图1 自然发病的卵形鲳鲹的临床症状

2.2病原的分离纯化及形态学观察利用BHI琼脂平板对病鱼进行病原分离，结果显示：病鱼脑部、肝脏、肾脏等部分均可分离出1株优势菌，优势菌占所在培养基平板上细菌总量的95%以上.菌落呈乳白色、圆形、表面光滑、边缘整齐、约0.6 mm（图2-A）；该优势菌在血平板（广东环凯微生物科技有限公司）上于30°C培养18 h后，其菌落呈乳白色，菌落周围为透明的β溶血圈（图2-B）.

图2 病原菌的菌落形态

2.3人工感染的试验结果人工感染的试验结果显示，将0.1 mL分离到的优势菌菌悬液（菌液稠密度为1×109CFU/mL）以腹腔注射的方式注射到卵形鲳鲹后，人工感染组的卵形鲳鲹于72 h内全部死亡，而对照组则无卵形鲳鲹死亡.病鱼主要呈现出缺氧、体色发黑、鳍条基部出血等症状，解剖后发现其腹腔有积液，其症状与自然发病的症状基本一致，从濒死鱼体中所分离的菌株与初次分离的菌株在形态和特征上是一致的.

2.4所分离的病原菌对卵形鲳鲹的LC50利用腹腔注射的方式感染卵形鲳鲹，其死亡主要发生在前4 d内，对照组则未出现死亡，其实验结果见图3，采用寇氏法［17］计算出病原菌的半致死浓度为6.863×105CFU/mL.

图3 海豚链球菌感染健康卵形鲳鲹的试验结果

2.5病原菌的鉴定

2.5.1病原菌16SrRNA基因序列及其系统发育分析将所分离到的菌株的16SrRNA基因序列与NCBI网站已有序列进行Blast比对，结果显示，所分离到的菌株与海豚链球菌的同源性最高，故选取同源性高的链球菌属的16SrRNA序列，利用Mega 7.0.26软件进行序列同源性分析和系统发育树的构建（图4），结果显示，所分离到的卵形鲳鲹致病菌株与海豚链球菌聚为一支，同源性最高为98%；同时，结合生理生化特性将所分离到的病原菌株判定为海豚链球菌.

图4 菌株的系统发育树

2.5.2生理生化特性用细菌生化鉴定管进行生理生化鉴定，其结果见表1，分离菌的生理生化特征与海豚链球菌的生化特性基本吻合.

表1 试验菌株的生化反应分析

2.6采用K⁃B纸片琼脂扩散法的药敏试验对所分离的菌株进行药敏试验，测量其抑菌圈大小，以产品说明书判断病原菌对各种药物的敏感性.实验结果如表2所示，试验菌株对青霉素类，如羧苄西林、苯唑西林、哌拉西林；头孢类，如头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢呋辛、头孢曲松、头孢哌酮；氨基糖苷类，如丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、新霉素；四环素类，如四环素、多西环素、米诺环素；大环内酯类，如红霉素、麦迪霉素等25种药品高度敏感；对氨苄西林、环丙沙星、头孢他啶、多粘菌素B则中度敏感；仅对青霉素耐药.

表2 菌株对药物的敏感性

3 讨 论

本研究对2020年7月在海南临高县桥头镇卵形鲳鲹养殖区爆发的细菌性疾病进行了病原菌的分离，通过人工感染试验观察到，实验鱼的发病症状与自然发病个体的症状基本一致，同时也证实了所分离的优势菌为该病的主要病原菌.其主要发病症状符合海豚链球菌病的发病症状［18］，通过对所分离菌株的形态学特征的观察和生理生化特性的分析，初步鉴定其病原菌为海豚链球菌；在进一步采用16SrRNA基因序列进行鉴定后，确定其与S.iniae（ATCC29178）的同源性最高，故该致病菌亦被初步鉴定为海豚链球菌，因此对于本次卵形鲳鲹所爆发的疾病，其主要病原可能为海豚链球菌.1976年，陆英杰等从患皮肤脓肿的亚马逊淡水海豚中首次分离出海豚链球菌，此后在养殖虹鳟中发现链球菌病［19］，再以后链球菌感染鱼体的情况呈全球性分布.近年来，在我国不同养殖区域相继有关于海豚链球菌感染鱼类并造成严重损失的报道［19-22］.陆英杰等［19］报道了在广州佛山某罗非鱼鱼场爆发海豚链球菌病的病例；郑李平［20］等报道了在四川彭州养殖鲟鱼上发生的以神经和出血症状为临床特征的病鱼，其体内分离到的病原菌为海豚链球菌；杨移斌［21］等报道了福建漳州地区养殖黄颡鱼上出现海豚链球菌病的症状.本研究也发现在海南省临高县桥头镇的养殖基地，卵形鲳鲹的体表及其重要组织器官亦出现符合海豚链球菌感染鱼类的症状［18］.由此表明，海豚链球菌对我国水产养殖行业的危害日趋严重，应给予高度关注.据文献报道，在海豚链球菌感染的不同种类宿主中，其主要症状具有一定的差异［23］.在感染哺乳动物时宿主主要呈现蜂窝组织炎、脑膜炎及皮下脓肿等，而在鱼类中宿主主要呈现眼球突出、全身性败血及脑膜炎等症状［24］.此外，不同水生动物（宿主）的发病表现也有所不同，如在海豚上其表现为皮肤脓肿［9］；鲟鱼则主要表现为全身性多组织和器官变性、坏死和出血等［20］；罗非鱼却主要表现为眼球突出或单边混浊发白、眼眶充血和肛门红肿等，且在解剖病鱼后可见其胆汁稀薄和色浅［19］.本研究还发现，卵形鲳鲹感染海豚链球菌后其主要症状为体色变黑、鳍基和肛门出血，并且鳃部呈现出明显的出血和充血；解剖后还可发现，其脾脏和肝脏肿大并有出血.这是与鱼的种属特异性还是与病原菌的生物学特性有关还有待进一步的研究.

本研究中的药敏实验结果显示，自卵形鲳鲹分离出的海豚链球菌对大部分四环素类、头孢类和氨基糖苷类等药物呈高度敏感，但对青霉素有耐药性；武沛文等［8］的研究发现，从湛江市太平镇网箱养殖场的卵形鲳鲹鱼体中分离到的海豚链球菌对四环素类和氨基糖苷类药物等17种试验药物敏感，但也对青霉素有耐药性，这与本研究的结果相似.这很可能是水产养殖场长期使用青霉素而引起的［25-26］.因此，建议采用对四环素类、头孢类和氨基糖苷类等敏感的药物来进行防治，但在使用过程中要避免反复加大量地使用单一抗生素，以避免病原菌出现耐药现象；同时应鼓励开发绿色的和安全的防治手段.目前，国内外已有学者开展了有关海豚链球菌疫苗的研究［27-30］，如袁国尚等［31］的研究表明，九味羌活汤和桑菊饮这2种复方中草药对鲟鱼海豚链球菌具有较好的抑菌和杀菌效果；姚丽等［32］的研究也证实，黄连、黄芩、连翘、丁香和秦皮对海豚链球菌均具有较好的抑菌和杀菌功效.但是，目前对中草药的作用机理尚未弄清，还有待做进一步的研究和开发，唯有如此才能更好地控制海豚链球菌对水产养殖行业的影响.