染料木黄酮抑制AKR1C3抗去势抵抗前列腺癌的生长及其机制研究

陈 晋，伏天雨，刘 江，周恒平，孙永霞，陈思琪，艾 丽，朱彦锋

（成都医学院公共卫生学院，四川成都 610500）

前列腺癌是中老年男性常见肿瘤之一，中国前列腺癌的发病率也逐年增加[1-2]。前列腺癌是一类雄激素依赖性肿瘤[3]。早期发现雄激素剥夺治疗（ADT）以降低睾酮水平能有效抑制前列腺癌的生长，但后续证实，经过ADT后，前列腺癌会发展成为去势抵抗前列腺癌（CRPC），且患者生存期明显降低[4-6]。因此，CRPC的防治是现今前列腺癌研究的重点[3,7]。现阶段，临床上有很多化疗药、激素抑制剂、肿瘤疫苗用于治疗CRPC[7-9]。但这些化学合成药物治疗后均带来副作用。因此，寻找能够用于治疗CRPC的低毒性药物，对于CRPC的临床治疗具有重要意义。

Aldo-keto还原酶家族1成员C3（AKR1C3）是一种类固醇合成酶，是雄激素（T和DHT）合成最后两步的关键酶[10-11]。前列腺癌作为一种雄激素依赖性的肿瘤，雄激素的含量变化对其生长具有较大的影响[12]，文献表明，在CRPC组织中AKR1C3 mRNA和蛋白水平均有上调，AKR1C3 siRNA能够抑制AKR1C3 mRNA，进 而 抑 制CRPC的 生 长[13-14]。AKR1C3的异常表达不仅能对恶性肿瘤和内分泌疾病产生影响，更与CRPC的恶性程度直接相关，是前列腺癌进展成为CRPC的适应性反应[6,15-16]。近期研究发现，AKR1C3抑制剂在癌症领域中的使用逐渐广泛，对于抑制AKR1C3表达来降低雄激素合成的方式，可作为抗CRPC的新靶标[17-18]。

染料木黄酮（GEN）作为一种高活性的天然植物雌激素，在大豆中的含量高于其他植物。GEN具有多种分子效应，如抑制炎症、促进细胞凋亡、调节甾体激素受体和代谢途径[19]。有学者通过研究证实染料木黄酮不仅能影响癌细胞的增殖，也能减轻炎症和脂肪的生成，预防肥胖和代谢综合征[20-22]。所以GEN具有的多种分子效应在预防和治疗常见的疾病中发挥着重要的作用。

近年来，GEN被证实具有抑制CRPC细胞增殖的效应[23]，但其作用机制尚未完全阐明。为探究GEN抑制AKR1C3的表达，继而发挥抗去势抵抗前列腺癌生长的作用机制。本研究从雄激素合成途径出发，拟通过膳食中最常见的大豆异黄酮活性单体GEN处理CRPC细胞，利用细胞培养、蛋白印记及其他分子生物学技术方法，从体外探讨GEN对去势抵抗前列腺癌增殖影响及GEN降低AKR1C3蛋白的表达，研究大豆异黄酮类植物激素物质抗去势抵抗前列腺癌的新机制，为预防和治疗去势抵抗前列腺癌丰富理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人去势抵抗前列腺癌22RV1细胞、人去势抵抗前列腺癌VCaP细胞、正常前列腺上皮细胞RWPE-1细胞 中国科学院；1640培养基、DMEM培养基

中国上海；胎牛血清 美国Gibco；染料木黄酮干粉、AKR1C3抑制剂（ASP-9521） MCE（中国）；AKR1C3 siRNA 吉玛基因（中国上海）；转染试剂盒

赛默飞（美国）；CCK-8试剂盒、IP细胞裂解液碧云天（中国）；BCA蛋白定量试剂盒 Solarbio（中国上海）；PSA单抗、AKR1C3单抗（Abcam）；BACTIN单抗 中杉金桥。

电泳装置 Bio-Rad（美国）；冷冻离心机、酶标仪、凝胶成像仪 Thermo（美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 培养22RV1、VCaP和RWPE-1细胞株，22RV1用无酚红RPMI-1640培养基（含10%的活性炭-葡聚糖处理的胎牛血清）培养，VCaP细胞用无酚红DMEM培养基（含10%的活性炭-葡聚糖处理的胎牛血清）培养，RWPE-1用RPMI-1640培养基（含10%的胎牛血清）培养，细胞培养环境为37 ℃、5% CO2的培养箱中。

1.2.2 细胞转染 取对数生长的22RV1、VCaP细胞，按每孔2×105个接种至6孔板底部，待密度长至80%时更换培养液加入无酚红RPMI-1640、DMEM培养基1.5 mL，分别用5 μg的小干扰RNA，AKR1C3-homo-77、AKR1C3-homo-447和 AKR1C3-homo-1008与5 μL转染试剂联合处理，置于培养箱培养4～6 h后在荧光显微镜下观察NC孔，如有荧光且在细胞中分布均匀后，则将每孔用PBS润洗两次后换DMEM完全培养基继续培养48 h。48 h后进行细胞裂解并提取蛋白质，进行Western blot检测[24]。如表1所示为AKR1C3 的siRNA引物序列。

表1 AKR1C3 的siRNA引物序列Table 1 siRNA primer sequences of AKR1C3

1.2.3 CCK-8法检测细胞生长情况 取对数生长期的22RV1、VCaP和RWPE-1细胞接种于96孔板中培养24 h，37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h，次日用无菌PBS润洗后，加入（0、12.5、25、50、100）μmol/L的GEN工作液处理48 h，每组设5个复孔。加入工作液24、48、72 h 后，分别加入含CCK-8 的培养基100 μL孵育4 h。采用酶标仪测定每孔吸光度（OD），波长设为450 nm[25]，按公式进行计算：细胞活性（%）=（OD加药-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100。

1.2.4 小干扰RNA和AKR1C3抑制剂对AKR1C3表达量的影响 为证实GEN抗去势抵抗前列腺癌细胞的增殖是通过抑制AKR1C3的表达实现的，用AKR1C3 siRNA和AKR1C3抑制剂（ASP-9521）处理细胞，观察二者的效果。体外培养22RV1、VCaP细胞，按每孔2×105个接种至六孔板底部，待密度长至80%时更换培养液，加入无酚红RPMI-1640、DMEM培养基1.5 mL，用最优AKR1C3 siRNA 447进行试验，使用5 μg AKR1C3 siRNA 447和GEN（50 μmol/L）单独或联合处理48 h。使用50 nmol/L AKR1C3抑制剂（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）单独或联合处理48 h，Western blot分析22RV1、VCaP细胞中AKR1C3的表达[26]。

1.2.5 Western blot法检测 用5个不同浓度（0、12.5、25、50、100）μmol/L GEN处理细胞48 h后，加入200 μL的IP裂解液，放置在冰上裂解30 min，在4 ℃下12500 r/min离心10 min，得到上清液置于-20 ℃保存备用。制备SDS-PAGE凝胶，在80 V（浓缩胶）/120 V（分离胶）恒压条件下分离蛋白质，在250 mA恒流转膜90 min。PVDF膜用20 mL封闭液放置于常温下封闭2 h，取出PVDF膜用1×TBST清洗3次，每次5 min，裁剪所需要条带并放入相应的一抗中，4 ℃封闭过夜。次日取出条带，用1×TBST溶液洗膜3次，每次6 min，再用二抗，室温孵育90 min。用1×TBST溶液洗膜3次，每次6 min，准备化学发光成像[26]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 GEN对CRPC细胞活力的抑制作用

GEN作为一种植物雌激素，能够有效抑制去势抵抗前列腺癌细胞的增殖、抑制转移和诱导凋亡[26-27]。研究结果显示，GEN（50、100 μmol/L）处理后，能够明显抑制22RV1、VCaP细胞增殖（图1A）。为进一步研究GEN对CRPC细胞功能的影响，以Western blot测定PSA蛋白的表达。PSA作为前列腺癌治疗的分子目标，是因为其不仅活跃在前列腺组织，在前列腺癌信号通路也会产生扩散、入侵、转移、血管生成、细胞凋亡、免疫反应、肿瘤微环境监管等影响，因此血清中PSA水平与疾病进展相关[28]。本研究结果显示，GEN对RWPE-1细胞活力无显著的抑制作用（P＞0.05），GEN（50、100 μmol/L）对PSA表达具有显著抑制作用（P＜0.05）（图1B）。

2.2 染料木黄酮对22RV1、VCaP细胞中AKR1C3表达的抑制作用

研究表明，在前列腺癌转化为CRPC的过程中，会产生更多的睾酮，AKR1C3呈异常高表达，将导致更多具有活性的雄激素合成[29]，因此AKR1C3的异常表达可能是前列腺癌由激素依赖性向CRPC转化的生物学标志。结果显示（图2），GEN（25、50、100 μmol/L）处理后条带灰度减弱，因此GEN（25、50、100 μmol/L）对AKR1C3表达具有明显抑制效果。结合图1结果，GEN处理后，GEN 50 μmol/L时首次出现能够明显抑制22RV1、VCaP细胞增殖及PSA表达的现象，因此选用GEN浓度为50 μmol/L进行后续实验。

图1 GEN对22RV1、VCaP细胞增殖能力的影响Fig.1 Effect of GEN on the proliferation ability of 22RV1 and VCaP cells

2.3 AKR1C3 siRNA447对22RV1、VCaP细 胞 中AKR1C3表达的抑制作用

图3 结果显示，综合AKR1C3siRNA抑制22RV1、VCaP细胞中AKR1C3表达的结果，可以看出AKR1C3 siRNA447的条带灰度减弱最明显，因此AKR1C3 siRNA447对AKR1C3的抑制效果最为明显。故选用AKR1C3 siRNA447进行后续实验。

图3 AKR1C3 siRNA抑制22RV1、VCaP细胞中AKR1C3表达的结果Fig.3 Inhibitory effect of AKR1C3 siRNA on AKR1C3 expression in 22RV1 and VCaP cells

2.4 AKR1C3 siRNA 447和GEN（50 μmol/L）对22RV1、VCaP细胞中AKR1C3表达的抑制作用

如图所示（图4），与对照组相比，样品组条带灰度明显低于对照组，且联合使用时现象更为明显。由此推断，AKR1C3 siRNA447、AKR1C3抑制剂（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）对AKR1C3均有抑制作用，且AKR1C3 siRNA447和AKR1C3抑制剂（ASP-9521）分别与GEN（50 μmol/L）联合作用时效果更强（图5）。由此推测，GEN对AKR1C3的抑制机制与AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制剂（ASP-9521）抑制AKR1C3相似。类似Pippione等[18]发现AKR1C3抑制剂可拮抗DHEA诱导的DuCaP生长，以非选择性的方式抑制AKR1C3的表达；以及Batra等[30]发现染料木素联合多糖可抑制前列腺癌细胞内雄激素的合成。

图4 AKR1C3抑制剂（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）联合处理对22RV1、VCaP细胞中AKR1C3的表达的影响Fig.4 Effect of combined treatment of AKR1C3 inhibitor(ASP-9521) and GEN (50 μmol/L) on the expression of AKR1C3 in 22RV1 and VCaP cells

3 结论

实验通体外培养22RV1、VCaP、RWPE-1细胞，使用不同浓度的GEN处理48 h。利用CCK-8检测22RV1、VCaP、RWPE-1细胞增殖活力。结果显示GEN不抑制RWPE-1细胞的生长，GEN（50、100 μmol/L）能明显抑制22RV1、VCaP的生长。后续Western blot检测得出，GEN（50、100 μmol/L）浓度对前列腺癌标志性抗原PSA蛋白和AKR1C3的表达均有抑制作用。由于AKR1C3是雄激素合成过程中的关键酶，通过使用AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制剂（ASP-9521）分别与GEN单独/联合处理22RV1、VCaP细胞，推测GEN抗去势抵抗前列腺癌的生长是通过抑制AKR1C3的表达现实的。在前述实验中，GEN 50 μmol/L为首次出现抑制作用的浓度，所以选择GEN 50 μmol/L处理后续实验。Western blot检测AKR1C3的蛋白表达量，Western blot结果显示，GEN 50 μmol/L能够抑制细胞中AKR1C3蛋白的表达，且与AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制剂（ASP-9521）联合作用时，对AKR1C3的抑制效果更为显著。AKR1C3的抑制可延缓CRPC的发生、发展，增加患者的生存时间，为临床上使用植物雌激素治疗去势前列腺癌的治疗提供的新思路，研究结果为通过多食用豆制品预防前列腺癌提供了理论依据。