火麻油中五种大麻素的HPLC同时检测

孙冬梅，兰 韬 ，云振宇，于聪聪，初 侨，张维冰

（1.华东理工大学，上海 200237；2.中国标准化研究院，北京 100191）

火麻油是以工业大麻籽冷榨产生的油脂类产品，其含有高达80%的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）[1]，ω-6/ω-3的比例为3:1，这与欧洲食品安全局的建议[2]一致。火麻油营养丰富，长期食用可有效补充人体必需营养素α-亚麻酸，润燥滑肠、有益于心脑血管健康，具有延年益寿的功效[2]。同时其中含有Δ9-四氢大麻酚（Δ9 Tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（Cannabidiol，CBD）、大麻酚（Cannabinol，CBN）、四氢大麻酚酸（Tetrahydro-cannabinolic Acid，THCA）、大麻二酚酸（Cannabidiolic acid，CBDA）等大麻酚类物质。除THC具有影响中枢神经的作用而受到管控外，CBD、CBN等物质也具有降低血脂、血压、血糖等保健功效[3-5]，CBD在医学上对癫痫[6]、抑郁症[7]、多发性硬化症[8]等疾病也具有明显的治疗作用。

由于火麻油的原料及制备工艺不同，其中THC、CBD、CBDA、CBN、THCA等大麻素的含量也存在很大差异[9-11]。随着工业大麻食品的日益普及，美国、德国、瑞士、比利时、欧洲工业大麻协会（European Industrial Hemp Association，EIHA）等许多国家相继发布了政策和法规，对火麻油等消费产品中THC的上限进行了规定[12]。我国也存在大量火麻油类产品，却尚未出台关于工业大麻食品中THC、CBD等大麻素的限量标准以及检测标准，相关标准的缺失导致无法把控产品质量，造成市场上火麻油产品良莠不齐。为了保证火麻油类食品的安全性，同时为了兼顾火麻油类食品的功能性，需要建立标准化的火麻油中几种常见大麻酚类物质的检测方法，为后续建立相应标准，以及进行相关产品质量安全监测奠定基础。

由于大麻素的结构相似以及这些物质之间存在的转换关系[13-15]，如图1所示，这对分析方法的准确性提出了较高要求。目前报道了大量针对不同基质中多种大麻素的检测方法，主要检测手段包括GCFID[16]、GC-MS[17]、HPLC-DAD[18-21]、HPLC-MS[22-24]

图1 5种大麻素结构式及相互转换图Fig.1 Structural formulas and mutual conversion diagrams of 5 cannabinols

等。由于GC会在加热的过程中使一些大麻酚酸类物质转化为大麻素类物质，不利于大麻酚酸类物质的检测，所以在同时检测大麻素和大麻酚酸类物质时通常使用HPLC的方法。研究人员在早期通常采用常规的C18填料对多种大麻素进行分离分析。随着一些特殊的选择性固定相的诞生，研究者开始尝试用这些新颖的固定相对这些大麻素进行选择性地分离分析，并取得了较好的分离效果[25-26]。如Hädener等[27]基于C8核壳结构固定相对干燥大麻植株中THC、THCA、CBD、CBDA、CBN五种大麻素进行了分离。Ciolino等[28]采用芳基改性的C18固定相，发展了工业大麻相关产品中11种大麻素的检测方法，都取得了较好的分离选择性。作为工业大麻相关产品中最常见的几种大麻素，THC、THCA、CBD、CBDA、CBN被研究的最多。而针对这几种常见的大麻素，不需要使用特殊选择性的固定相，使用常规的C18固定相即可实现良好的分离效果。

为了发展一个标准化的、普适性好的火麻油中THC、THCA、CBD、CBDA、CBN等大麻素的检测方法，本文广泛采集了国内山西、广西、陕西、黑龙江4个不同产地的火麻油，并根据不同产地火麻油基质的特点，通过优化前处理条件和色谱条件，发展了一种普适、简单、稳定、准确的火麻油中五种大麻素的检测方法，并通过方法学验证，实现检测方法的标准化，为相关产品的质量控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大麻素标准品：CBDA、CBD、CBN、THC、THCA标准品（1 mg/mL，1 mL） 美国Cerilliant公司；甲醇、乙腈 色谱纯，德国Merck公司；异丙醇 色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；4个产地火麻油（山西、陕西、广西、黑龙江） 网购。

iChrom5100分析型国产液相色谱仪（配DAD检测器）、Supersil-ODS2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 大连依利特分析仪器有限公司；Thmorgan-VM200型涡旋振荡器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII离心机 日立公司；Sartorius分析天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；ELGA纯水仪 北京诚驿恒仪科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 流动相 流动相A为纯水，为实验室纯水仪自制，电导率为18.2 MΩ，使用前经水相滤膜抽滤，超声脱气。

流动相B为乙腈（色谱纯），使用前经有机相滤膜抽滤，超声脱气。

1.2.1.2 标准溶液 混和标准储备液：取CBDA

（1 mg/mL）、CBD（1 mg/mL）、CBN（1 mg/mL）、THC（1 mg/mL）、THCA（1 mg/mL）标准品转移至10 mL容量瓶中，加入混合溶剂（甲醇:异丙醇=80:20，v/v）定容，配制成100 μg/mL的5种大麻素混和标准储备液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期为30 d。

标准工作溶液：准确吸取混合标准储备液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL分别置于10 mL容量瓶中，用混合溶剂（甲醇:异丙醇=80:20，v/v）定容，配制为质量浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的系列混合标准工作溶液，现用现配。

1.2.2 样品前处理 准确称取0.5 g（精确到0.001 g）火麻油于10 mL离心管中，加入2.5 mL混合溶剂（甲醇:异丙醇=80:20，v/v），涡旋2 min混匀，超声提取15 min，提取液以10000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜后待测。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱为Supersil-ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm），进样体积为10 μL，流速1 mL/min，柱温：35 ℃，检测波长为220 nm，流动相A相为超纯水，流动相B相为乙腈，梯度洗脱条件为0～20 min，70%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～70%B；24～30 min，70%B。

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 标准曲线 将配制好的0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL标准工作溶液按“1.2.3”的液相色谱条件进样分析，分别以5种化合物的浓度为横坐标，峰面积响应值为纵坐标，绘制系列标准曲线，进行线性回归，得到5种大麻素的标准曲线线性回归方程。

1.2.4.2 定量限、检出限 将1.2.1.2的标准系列溶液按“1.2.3”的液相色谱条件测定，测得5种大麻素的峰面积，带入相应物质的标准曲线回归方程中。以最低水平标准溶液中目标组分的3倍平均信噪比为检出限（LOD），10倍平均信噪比为定量限（LOQ），计算得本方法的LOD和LOQ。

1.2.4.3 精密度试验 在相同仪器条件下，取1 μg/mL浓度的标准工作溶液, 按“1.2.3”色谱条件连续进样6次，测得峰面积，代入标准曲线线性回归方程得出测定浓度值，再计算测定浓度的相对标准偏差RSD。

1.2.4.4 重复性试验 在相同的仪器条件下，精密称取0.5g（精确到0.001 g）火麻油6份，按“1.2.2”项下方法操作，将处理好的6份待测液按“1.2.3”色谱条件进样分析，测得5种大麻素峰面积，代入标准曲线方程，计算测定浓度的标准偏差RSD。

1.2.4.5 加标回收率 准确称取陕西产的火麻油0.5 g（精确到0.01 g）12份，编号1～12，其中1～3号作为本底，4～6号加标配成0.5 μg/mL待测液，7～9号加标配成1 μg/mL待测液，10～12号加标配成5 μg/mL待测液，按“1.2.2”项下方法操作，将处理好的本底待测液以及低、中、高3种浓度的加标样品经HPLC分析，测得峰面积，计算回收率。

1.3 数据处理

本文标准曲线线性回归方程及相关系数由依利特ichrom5100 workstation处理所得，其他数据采用Origin8.5和Excel2010软件对数据进行处理并作图，实验数据取3次平行实验的平均值

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件优化

为尽可能的将待测的五种大麻素类物质与火麻油中的基质成分的分离，首先对流动相梯度程序进行了优化。以山西火麻油的甲醇提取液为本底溶液，向其中添加了5 μg/mL混合标准品，采用两种不同的流动相梯度程序对本底液和加标液分别进行了色谱分离，两种流动相梯度程序分别为：程序1：0～20 min，80%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～80%B；24～30 min，80%B。程序2：0～20 min，70%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～70%B；24～30 min，70%B。分离结果如图2所示，并通过单标法对峰的归属进行了确证。结果表明在梯度程序1下CBD无法与火麻油基质成分分离，THC和THCA分离度较差。而经过降低初始有机相的组成，在梯度程序2下，火麻油中各个峰分离情况较好，且基质中杂质峰和待测的五种大麻素的色谱峰没有相互掩盖，所以后续实验都采用梯度程序1进行实验优化和方法验证。并且从图2可以看出，通过调整流动相的比例，改变洗脱条件，能够实现将基质中杂质峰与被分析物色谱峰分离的效果，降低了杂质峰干扰的可能，从而省去对提取液进行净化处理的步骤，使得操作简便、耗时较短。

图2 两种梯度程序下5 μg/mL加标混合标准品的火麻油甲醇提取液样品色谱图Fig.2 Chromatograms of the hemp oil methanol extract with a spiked concentration of 5 μg/mL under two different gradient programs

2.2 提取溶剂优化

根据5种大麻素的结构、极性、溶解性等性质[29-30]，选择合适的提取方法和提取溶剂是检测的重要前提。有较多文献[26,30]选择使用甲醇作为提取溶剂，提取火麻油中的大麻酚类物质。考虑到异丙醇可以和水、脂肪类化合物以及较多有机物都有较好的互溶，并且其闪燃点、爆炸极限等安全性能都较好，对环境和人体健康影响较小，常被用于植物提取物的提取。

因此，在仪器及实验条件相同情况下，本实验选择了100%甲醇；甲醇:异丙醇=80:20；甲醇:异丙醇=50:50的3种溶剂，取相同火麻油样品，向其中添加了5 μg/mL混合标准品，采用“1.2.2”的样品提取方式，分别用以上3种溶剂进行提取，并测定加标回收率，结果如下表1。从表1中可以看出，添加了异丙醇后，样品的回收率可以控制在70%～100%之间，其中以甲醇:异丙醇=80:20进行提取，结果具有更好的稳定性，可以控制RSD＜5%。所以在后续实验中采用甲醇:异丙醇=80:20的提取溶剂进行提取。

表1 3种不同溶剂提取结果对比Table 1 Comparisonof extraction results of three different solvent

2.3 标准曲线、定量限、检出限

对5种大麻素混合标准溶液系列进行测定，通过ichrom5100 workstation绘制标准曲线回归方程，其线性范围、相关系数、LOD及LOQ如下表2所示。由表中数据可知，本方法在0.5～50 μg/mL范围内有较好的线性关系，相关系数r均＞0.998。经计算，5种大麻素的检出限（LOD，S/N=3）均在0.10～0.25 mg/kg之间，定量限（LOQ，S/N=10）均在0.33～0.83 mg/kg之间，与国家司法鉴定技术规范方法[31]的LOD接近（0.05 ng/mg），但由于该方法使用的是液相色谱串联质谱方法进行检测，而本方法使用常规的HPLC进行检测，所以本方法在经济适用的基础上，检测灵敏度也具有较强竞争力。

表2 5种大麻素的线性范围、LOD和LOQTable 2 Linear range, LOD and LOQ of 5 kinds of cannabidiol

2.4 精密度

按照“1.2.4.3”实验步骤，在1 d内平行测定6次1 μg/mL的混合标准溶液，测得的CBDA、CBD、CBN、THC、THCA五种大麻素的浓度与RSD如下表3所示。由上表数据可知，精密度实验结果RSD在0.7%～3.9%之间，表明仪器精密度良好，使用该仪器进行检测，可以保证方法的结果准确。

表3 精密度实验结果（μg/mL）Table 3 Precision test results (μg/mL)

2.5 重复性

以陕西产的火麻油为样品，按照“1.2.4.4”实验步骤，测得平行6组火麻油中CBDA、CBD、CBN、THC、THCA五种大麻素的浓度及RSD如下表4所示。由上表数据可知，6次重复实验的RSD在1.9%～3.2%之间，表明本方法重复性较好，结果准确性较好。

表4 重复性实验结果（μg/mL）Table 4 Repeatability experiment results (μg/mL)

2.6 加标回收率

在陕西产的火麻油实际样品中添加0.5、1、5 μg/mL的低、中、高三种浓度水平的大麻素混合标准溶液，用本实验方法进行测定，并计算回收率，结果如表5所示。由表中数据可知，5种大麻素的回收率在77.1%～103.3%，相对标准偏差RSD≤4.7%，表明本方法回收率好，结果准确可靠。

表5 加标回收率实验结果（n=3）Table 5 Recovery rate of three different spiked levels (n=3)

2.7 实际样品测定

以本方法的提取工艺和色谱条件对广西、黑龙江、山西、陕西4个产地的火麻油样品进行了分离分析，结果如图3所示。从图中可以看出，4个产地的火麻油中均或多或少的存在一定量的5种大麻素，这5种大麻素与基质中的其他物质实现了良好的分离，不影响这5种大麻素的定量分析。对山西、广西、陕西、黑龙江4个不同产地的火麻油中5种大麻素含量进行计算，计算结果见表6。实际样品分析结果表明，除山西火麻油中不含CBDA和THCA外，陕西、广西、黑龙江等3个产地的火麻油中5种大麻素都有检出，且具有成瘾性的THC的含量均＞3.2 mg/kg，其中陕西火麻油中THC含量甚至高达11.9 mg/kg。欧盟国家对工业大麻食品中特征大麻素THC含量的限定标准为10 mg/kg；2017年，澳大利亚和新西兰在澳新食品标准法典中修订了大麻籽及相关食品标准，规定火麻油中THC含量不高于10 mg/kg[32]；智利在2016年发布的通报中也规定大麻子食品中THC含量不得超过10 mg/kg。我国广西壮族自治区分别于2014、2015、2018年制定火麻油、火麻仁以及火麻糊的地方标准，允许以火麻籽为原料，经加工工艺制成的非直接食用的火麻仁添加到食品中[33-35]，但是都未对其中THC含量进行规定。从目前国内4个产地火麻油的监测结果可以看出，只有陕西火麻油中THC含量为11.9 mg/kg，超过了世界上主流国家对于工业大麻食品中THC含量的要求，有一定的食品安全风险，有关部门应加强监测，建议在火麻油标准中增加THC含量的限定指标，不应超过10 mg/kg。同时应制定相应的火麻油中大麻酚素检测方法标准，完善监管制度以保障食品安全。

表6 不同产地火麻油中5种大麻素含量（mg/kg）（n=3）Table 6 Contents of 5 cannabinols in hemp oil from different producing areas (mg/kg) (n=3)

图3 4个产区火麻油的分离谱图Fig.3 Chromatogram of hempseed oil from four different regions

3 结论

大麻籽和大麻籽油相关产品具有较高的蛋白质含量和营养价值，在消费者中很受欢迎，本文建立了一种基于高效液相色谱法的同时检测火麻油中5种大麻素的分析方法。通过调节流动相配比，优化色谱条件实现被测组分色谱峰与基质中杂质峰的有效分离，该分析方法操作简便、耗时较短、经济。同时经过精密度实验、重复性实验以及加标回收率实验等对本方法的有效性进行验证，结果表明，本方法的检出限、定量限、精密度、回收率等结果均较好，可用于实际样品的分析确证，同时可为相关检测方法标准的建立奠定方法学基础。通过对国内4个产地的火麻油进行检测，发现其中均含有THC，而且有部分产地火麻油中THC含量超过了世界上主流国家对于工业大麻食品中THC含量的要求（10 mg/kg），存在一定的食品安全风险，建议在火麻油标准中增加THC含量的限定指标，不应超过10 mg/kg，同时制定相应的火麻油中大麻素检测方法标准，实现对相关产品的质量控制，保障人民群众健康。