葡萄糖酸内酯酸化处理对未漂洗鲟鱼糜凝胶特性的影响

向晨曦，徐新星，刘 康，李钰金，高瑞昌，白 帆，汪金林, ，赵元晖,

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013；3.衢州鲟龙水产食品科技开发有限公司，浙江衢州 324004）

鲟鱼是一种体型较大的淡水鱼类，具有较高的经济价值和科研价值[1]。鲟鱼肉富含蛋白质和多不饱和脂肪酸，其中8种人体必需氨基酸配比均衡，营养非常丰富[2]。此外，鲟鱼肉厚骨软[3]，非常适合用来制作鱼糜。鱼糜是以海水鱼或淡水鱼为原料经过一系列加工制成的一种高蛋白、低脂肪、低胆固醇的水产食品，由于其营养健康、风味独特深受消费者青睐[4]。在传统鱼糜制作过程中，漂洗是其中最重要的步骤之一，它可以去除鱼肉中的水溶性蛋白质、色素、气味、脂肪以及无机离子等成分，从而提高鱼糜的凝胶强度和白度[5]。但同时漂洗出的蛋白和脂肪会造成营养物质大量流失及产率降低，漂洗后的废水也会引起环境污染，且操作复杂，费时费力[6]。因此，有必要开发未漂洗鱼糜产品解决上述问题。

葡萄糖酸内酯（GDL）是一种蛋白凝固剂，可水解释放葡萄糖酸，使体系pH降低，从而减弱蛋白分子间的静电斥力，在低温下诱导蛋白质聚集形成凝胶[7]。GDL添加量为2.4%可获得品质较高的罗非鱼碎肉蛋白凝胶[8]。有研究发现在低温条件下GDL可诱导肌肉蛋白形成凝胶网络结构[9]。但目前关于GDL对未漂洗鲟鱼糜凝胶特性影响鲜有报道。

本研究中以未漂洗鲟鱼糜为原料，探究在低温交联过程中不同GDL添加量对鱼糜凝胶化学作用力及胶凝特性的影响，以期为提高未漂洗淡水鱼糜品质和开发新型鱼糜制品提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鲟鱼（施氏鲟和西伯利亚鲟杂交幼年鲟，体质量（1.5～2 kg） 购买于青岛市城阳区水产养殖公司；食盐 食品级，青岛金贝欧公司；山梨糖醇、三聚磷酸钠、葡萄糖酸内酯 食品级，河南万邦实业有限公司；氯化钠、尿素、硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠、碳酸钠、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硝基苯甲酸（DTNB）、考马斯亮蓝R-250 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Tris 分析纯，美国Sigma公司。

TJ12-H绞肉机 广东恒联食品机械有限公司；FMB40雪花制冰机 上海冠森生物科技有限公司；NR60CP手持式色差仪 深圳市三恩驰科技有限公司；TMS-PRO质构仪 美国Food Technology公司；FJ-200高速均质机 上海标本模型厂；VL-5B高速离心机 湖南迈克尔实验仪器有限公司；LG10-3A冷冻离心机 北京医用离心机厂。

1.2 实验方法

1.2.1 未漂洗鱼糜的制备 将新鲜的鲟鱼用力击晕，然后去掉鱼头、鱼内脏和鱼皮，取下鱼肉切成小块，用冰水将小块鱼肉冲洗干净并放在碎冰上保持低温，再将鱼肉置于绞肉机（孔板直径为3 mm）中绞2～3遍。然后绞碎的鱼糜不经过漂洗、脱水等步骤，直接添加传统抗冻剂（0.25%三聚磷酸钠和4%山梨醇）并混合均匀，即为未漂洗鲟鱼糜（水分含量为76.67%±0.19%）。最后将鱼糜分装进自封袋中（每袋300 g），放在-20 ℃下冷冻待用。

1.2.2 未漂洗鱼糜凝胶的制备 将冷冻鱼糜从冰箱取出并在4 ℃下解冻，空擂2 min，然后加入1.5%食盐（以冷冻鱼糜重量计，下同）、不同添加量（0%、1%、2%、3%和4%）的GDL及冰水继续擂溃2 min，鱼糜中水分含量在80%左右。最后在4 ℃下放置24 h形成凝胶。

1.2.3 指标测定方法

1.2.3.1 pH的测定 取5.0 g样品，加入50 mL去离子水，均质30 s后静置30 min，取上清液，使用pH计测定pH。

1.2.3.2 凝胶强度的测定 根据ZHANG等[10]的方法略作修改。使用质构分析仪进行测定，参数设置如下：探头选用直径为5 mm的圆柱形探头，起始力为0.05 N，测试速度为1 mm/s，穿刺距离为10 mm。测定鱼糜的凝胶强度。每个样品测定8个平行。

1.2.3.3 质构的测定 参照常莉莉等[11]的方法略作修改。使用质构分析仪进行物性分析，参数设置如下：探头选用直径为35 mm的圆盘，起始力为0.05 N，测试速度为1 mm/s，形变量为40%，测定鱼糜的硬度、弹性、咀嚼性、内聚性、胶黏性和粘附性。每个样品测定8个平行。

1.2.3.4 持水性的测定 按照CAO等[12]的方法并稍作修改，称取约1 g样品（m1）用双层滤纸包裹，置于离心管中。将离心管放入4 ℃的离心机中以5000 r/min离心10 min，离心后取出样品称量（m2）。每个样品测定8个平行，按下列公式计算持水性：

1.2.3.5 白度的测定 将样品放置在室温下平衡30 min，采用手持色差仪进行测定其L*（亮度）、a*（红度）和b*（黄度），每个样品测定8次，按照如下公式计算白度[13]：

1.2.3.6 化学作用力的测定 参照NI等[14]的方法并略作修改。取2 g鱼糜样品分别溶于10 mL SA（0.05 mol/L NaCl）、SB（0.6 mol/L NaCl）、SC（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素）和SD（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素）4种溶液中，均质1 min，4 ℃下静置1 h，以10000 r/min的转速在4 ℃冷冻离心机中离心15 min，上清液中蛋白质含量采用双缩脲法测定。按照下列公式计算：

1.2.3.7 总巯基的测定 参考BENJAKUL等[15]的方法。取稀释至2 mg/mL的蛋白样品1 mL，加入0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（含8 mol/L尿素，2% SDS，10 mmol/L EDTA，pH6.8）9 mL，混匀后取4 mL混合液加入0.4 mL的0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（含0.1% DTNB，pH8.0），在40 ℃水浴反应25 min，于412 nm处测吸光度。使用蒸馏水作为空白对照。按如下公式计算总巯基含量：

式中：A为412 nm处的吸光度；V为稀释倍数；ε为吸光系数，13600 mol·cm/L；c为蛋白质浓度，mg/mL。

1.2.3.8 SDS-PAGE凝胶电泳 样品经前处理后，将样品加载到电泳仪上，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，在80 V电压下运行30 min，然后在120 V电压下运行3 h左右。电泳结束后用0.1%考马斯亮蓝R-250对凝胶振荡染色2 h，用醋酸-乙醇溶液脱色过夜[16]。

1.3 统计分析

使用IBM SPSS Statistics 24计算平均值和标准差，用Duncan多重检验进行数据的显著性分析（P＜0.05)，并采用Origin 2017进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶pH的影响

鱼糜凝胶pH随GDL添加量变化的情况如图1所示，不同浓度的GDL对鱼糜凝胶的pH影响程度不同。鱼糜不添加GDL时pH为6.54，由图可知，当GDL添加量逐渐增加，pH呈显著降低的趋势（P＜0.05），分别为5.48、4.76、4.35和4.02。这是由于GDL是一种弱酸酸化剂，易溶于水，可以水解产生葡萄糖酸，从而使得鱼糜凝胶的pH迅速下降。

图1 不同GDL添加量下鱼糜凝胶pH的变化Fig.1 Changes in pH of surimi gel under different GDL addition amounts

2.2 不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶强度的影响

凝胶强度可反映蛋白质凝胶内部结构的牢固程度[17]。如图2所示，当GDL添加量从0%逐渐增加到3%时，鱼糜凝胶强度呈增大趋势，且在添加量为3%时最大。但是随着添加量进一步增加，其凝胶强度显著降低（P＜0.05）。pH会影响蛋白质分子的电荷性质来影响蛋白质分子的聚集[18]，因此凝胶强度出现这种先升后降的现象其原因可能是GDL分解产酸，较低的pH诱导蛋白质变形聚集形成强度较大的凝胶[19]，但是GDL过量添加会导致pH持续降低，蛋白质分子表面电荷排斥作用加强，影响了蛋白聚集体的形成从而导致凝胶强度降低[20]。这与郑严等[21]使用不同GDL添加量处理真鲷鱼糜时得到的结果类似。ZHANG等[22]研究发现GDL通过调节pH改变了电荷和猪血浆蛋白（PPP）溶液的聚集状态，并得出0.3%GDL和0.2%转谷氨酰胺酶共存时可诱导形成硬度良好的PPP冷固性凝胶的结论。由此可推断适当的酸化可以形成凝胶性能优异的鱼糜凝胶。

图2 不同GDL添加量下鱼糜凝胶强度的变化Fig.2 Changes in gel strength of surimi under different GDL addition amounts

2.3 不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶质构的影响

如表1所示，随着GDL的增加，鱼糜凝胶的硬度和弹性增大，较高添加量的GDL会诱导形成高强度的鱼糜凝胶。硬度和弹性是反映鱼糜口感的重要参数，主要与参与形成凝胶网络结构的力有关。硬度在添加量为3%时最大，为19.84±2.26 N，之后进一步增加添加量对鱼糜的硬度没有产生明显的影响。从弹性指标来看，随着添加量的增加，弹性呈现上下往复变化，与对照组相比，总体有所提高。这表明较高的GDL添加量可通过迅速降低pH来增加蛋白分子间的结合力。当添加量从1%逐渐添加到4%时，内聚性、咀嚼性和胶黏性均呈现先持续增大后保持稳定的趋势。黏附性随着GDL的增加而显著降低（P＜0.05），这是由于不添加GDL时为擂溃后的鱼肉糊，探头压缩完与之分离时因为黏性高受到较大的牵引力，而添加GDL后鱼糜凝胶的黏性下降，黏附性随之降低。

表1 不同GDL添加量下鱼糜凝胶质构的变化Table 1 Changes in texture of surimi gel under different GDL addition amounts

2.4 不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶持水性的影响

持水性表示凝胶网络结构保持水分的能力，同时也能够在一定程度上反映出鱼糜的凝胶状况[23]。图3 反映了GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶持水性的影响，与对照组相比，随着GDL添加量的增加，鱼糜凝胶的持水性基本呈先升高后下降的趋势。当添加量为2%和3%时持水性最好，分别为87.26%±0.96%和86.82%±0.97%，二者之间无显著性差异（P＞0.05）。添加GDL后，酸诱导鱼糜凝胶网络结构形成，因此与对照组相比显著提高了鱼糜凝胶强度和持水性（P＜0.05），而另一方面可能是由于当添加量逐渐增加，蛋白分子内部的疏水基团逐渐暴露，疏水相互作用增大导致锁水能力下降[24]，这两方面综合影响了持水性的变化。高宇等[25]研究也发现GDL的添加有利于提高罗非鱼碎肉蛋白凝胶的持水性。

图3 不同GDL添加量下鱼糜凝胶持水性的变化Fig.3 Changes in water holding capacity of surimi gel under different GDL addition amounts

2.5 不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶白度的影响

一般来说，鱼糜凝胶的色泽会根据凝胶情况而表现出不同，白度越高表明鱼糜制品品质越高，越容易受到消费者的喜爱。由表2可知，添加GDL后的鱼糜凝胶白度显著高于对照组（P＜0.05），且白度值随着GDL添加量的增大而逐渐增大，但添加量超过3%时白度值变化不明显。白度增加是蛋白变性的结果[21]，与对照组相比较，GDL的添加明显提高了鱼糜凝胶的亮度值（L*）和白度值，由此可以推断出GDL影响了鱼糜蛋白的结构变化，增大了变性程度。此外，凝胶的白度值也会受到蛋白质组成以及鱼糜表面光学特性的影响[26]。

表2 不同GDL添加量下鱼糜凝胶白度的变化Table 2 Changes in whiteness of surimi gel under different GDL addition amounts

2.6 不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶化学作用力的影响

氢键、离子键和疏水相互作用等在鱼糜凝胶网络结构的形成中发挥的重要作用[27]。从图4中可以

看出，不添加GDL时鱼糜蛋白分子间作用力主要包括离子键和氢键，疏水相互作用所占比例很小。随着GDL含量的增加，氢键和离子键由于被破坏而逐渐降低，说明氢键和离子键不是维持GDL诱导鱼糜凝胶结构的主要化学作用力，而与对照组相比，疏水相互作用显著增强（P＜0.05），这表明在GDL低温诱导鱼糜凝胶化的过程中形成了更多的疏水相互作用，因此疏水相互作用是维持鱼糜凝胶网络结构稳定的主要化学作用力。高宇等[25]认为GDL酸处理使得蛋白变性，结构展开，疏水基团暴露从而形成疏水相互作用。而GDL添加量过高时，疏水相互作用减小，这与王琳[28]的研究结果相似，推测可能与蛋白质构下降有关。

2.7 不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶总巯基含量的影响

巯基是蛋白中反应活性最强的功能集基团，总巯基含量变化可间接反映二硫键变化，二硫键是维系凝胶体系的重要作用力[29]。由图5可知，整体上来看总巯基含量随GDL的增加呈先下降后升高的趋势，总巯基的减少是由于二硫键的形成，GDL降低了鱼糜凝胶的pH，导致蛋白质变性引起结构变化，暴露出的游离巯基被氧化形成了二硫键[7]，说明在酸诱导鱼糜凝胶网络结构形成的过程中也有少量二硫键的参与。但从图中可知，当GDL含量进一步增加至3%以上时总巯基含量升高，因此pH过低不利于二硫键的形成，在许艳顺[20]的研究中也发现了类似的结论。

图5 不同GDL添加量下鱼糜凝胶总巯基含量的变化Fig.5 Changes in total sulfhydryl content of surimi gel under different GDL addition amounts

2.8 SDS-PAGE凝胶电泳分析

不同GDL添加量的未漂洗鲟鱼糜凝胶的蛋白质电泳结果如图6所示。肌球蛋白重链（MHC，220 kDa）、肌动蛋白（AC，43 kDa）是鱼糜凝胶中的主要蛋白质，其中肌球蛋白是鱼糜凝胶网络结构形成的关键蛋白[30]。从图6中可以看出，与对照组相比，添加GDL后鱼糜凝胶MHC条带的强度呈现出一定程度的减弱，表明了肌球蛋白发生了变化，在酸化诱导鱼糜凝胶的过程中MHC通过催化交联形成了更多的ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸键，从而提高了鱼糜凝胶的质构特性[31]。AC条带的强度随着GDL添加量的增加逐渐减弱，但继续增加GDL添加量AC条带没有明显变化。杨明柳等[32]研究发现向鳜鱼鱼糜中添加谷氨酰胺转胺酶后MHC和AC条带减弱，促进了蛋白交联。

图6 不同GDL添加量下鱼糜凝胶蛋白变化的电泳图Fig.6 Electrophoresis patterns of surimi gel protein under different GDL addition amounts

3 结论

不同GDL添加量对未漂洗鲟鱼糜凝胶特性的影响实验结果表明，与对照组相比，添加GDL后可以显著提高未漂鲟鱼糜凝胶的凝胶强度、硬度、咀嚼性、胶黏性、白度和持水性（P＜0.05），并且在添加量为3%时达到最大。过量GDL会导致蛋白质聚集受到影响从而减弱鱼糜凝胶特性。在GDL酸化诱导鱼糜凝胶过程中，疏水相互作用是维持鱼糜凝胶网络结构稳定的主要作用力。总巯基含量和SDSPAGE凝胶电泳结果表明二硫键的增加和蛋白质共价交联程度的提高促进了鱼糜凝胶网络结构的形成。综上，GDL添加量为3%时可获得品质较好的鱼糜凝胶。这项研究为开发低温凝胶化鱼糜制品提供了重要理论支撑。