高效液相色谱法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中7 种成分

昝珂，周颖，郑成

（1.中国食品药品检定研究院，北京 102629；2.浙江省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，杭州 310052）

鱼腥草芩蓝合剂为常见中药制剂，由鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘、金银花5 味中药材配制而成，具有清热解毒的作用，临床常用于治疗外感风热引起的咽喉肿痛，急性咽炎、扁桃体炎等疾病。现代药理研究表明，该制剂具有良好的解热作用，临床治疗小儿疱疹性咽峡炎有较好的疗效［1-4］。鱼腥草芩蓝合剂收录于国家药品监督管理局国家中成药标准中，然而现行标准中只有鱼腥草、黄芩、连翘和金银花的薄层色谱鉴别项和黄芩苷含量的测定项［5］，不能全面地反映复方制剂的内在质量。目前有关该制剂组分含量的测定研究较少，邓茂芳等［6］建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中绿原酸、黄芩苷和黄芩素含量的方法。鱼腥草芩蓝口服液是同方配制的兽药制剂［7］，陆安等［8］以鱼腥草芩蓝口服液为研究对象，建立了HPLC 指纹图谱鉴别方法，但未进行含量测定研究；邢玉娟等［9］建立了HPLC 法测定鱼腥草芩蓝口服液中黄芩苷和绿原酸含量的方法。鱼腥草中含有绿原酸、槲皮素、槲皮苷等化学成分［10-11］；黄芩中含有黄芩苷、汉黄芩素和汉黄芩苷等成分［12-13］；连翘中含有绿原酸、槲皮素、槲皮苷、连翘酯苷A 等成分［14-15］；金银花中含有绿原酸、槲皮素和槲皮苷等成分［16-17］。笔者在前人研究的基础上，对试验条件进行优化，建立了HPLC 法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素7 种成分含量的方法，为全面控制该制剂的质量提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Ultimate U3000 型，配有Chromeleon 7.2SR5 色谱工作站、真空脱气机、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

电子天平：XPE205 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超声波提取器：ELMA SONIC P 型，德国艾尔玛公司。

纯水仪：Milli PAK advantage A10 型，美国密理博公司。

复方鱼腥草合剂样品：某生产企业样品。

绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素、汉黄芩素对照品：批号分别为18071907、A19011704、18041002、19091104、18032111、19082203、18030509，纯度（质量分数）分别 为96.1%、97.2%、93.3%、100.0%、98.5%、98.8%、99.1%，成都普菲德生物技术有限公司。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国赛默飞世尔公司。

磷酸，分析纯，国药集团化学试剂（北京）有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 溶剂配制

对照品单标储备液：分别精密称取绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素对照品各约10 mg，其中黄芩苷置于10 mL 容量瓶中，其它6 种化合物分别置于100 mL 容量瓶中，各加入50%甲醇溶液溶解，稀释，定容至标线，配制成绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素的质量浓度分别为98.5、102.4、994、97.8、101.2、98.8、103.2 μg／mL 的 单 标储备液。

混合对照品溶液：分别精密量取上述对照品单标储备液各1 mL，置于同一只10 mL 容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀释并定容至标线，摇匀，配制成绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素、汉黄芩素的质量浓度分别为9.85、10.24、99.4、9.78、10.12、9.88、10.32 μg／mL 的混合对照品溶液。

1.3 样品处理

精密量取鱼腥草芩蓝合剂2 mL，置于20 mL棕色容量瓶中，加入50%甲醇溶液12 mL，超声20 min，冷却至室温，用50%甲醇溶液稀释至标线，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，待测。

1.4 色谱条件

色 谱 柱：Symmetry Shield RP18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美国沃特世公司)；流动相：乙腈-0.1%甲酸溶液；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：初始乙腈体积分数为20%，0～30 min，乙腈由20%逐渐增加至40%，保持30 min，60～80 min，乙腈由40%逐渐增加至80%；流量：1.0 mL／min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL。

2 结果与讨论

2.1 检测波长选择

所测7 种化合物中，绿原酸为咖啡酰奎宁酸类，紫外光谱最大吸收峰为327 nm；连翘酯苷A 为苯乙醇苷类，最大吸收为330 nm；其余成分为黄酮或黄酮苷类，黄芩苷最大吸收波长为278 nm，槲皮苷为254 nm 和350 nm，汉黄芩苷为276 nm，槲皮素为370 nm，汉黄芩素为276 nm。各成分之间紫外最大吸收波长差别较大，但在210 nm 处均有较强的紫外吸收，故选择210 nm 作为检测波长同时检测7种成分。

2.2 色谱条件优化

分别选择乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相，考察不同流动相体系对7 种待测成分的分离效果。结果表明，乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相时，色谱峰形较好，故选择乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相。由于7 种待测化合物极性跨度较大，采用等度洗脱无法对所有化合物进行分离，故采用梯度洗脱方式。对梯度洗脱程序进行优化，最终确定洗脱程序：初始乙腈体积分数为20%，0～30 min，乙腈由20%逐渐增加至40%，保持30 min，60～80 min，乙腈由40%逐渐增加至80%。在此洗脱程序下，7 种化合物在80 min 内获得较好的分离，峰形较好。

2.3 色谱柱选择

分别对SymmetryShield RP18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse XDB 柱（250×4.6 mm，5 μm）和ODS HHPERSIL 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) 3 种型号的色谱柱进行考察，结果发现，SymmetryShield RP18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱分离效果最佳，故选择该色谱柱进行方法学考察和样品测定。

2.4 样品提取条件选择

样品为口服液体制剂，溶解性较好，但个别化合物浓度较高，故采用50%甲醇对样品制剂稀释10 倍，过滤后直接进样测定。混合对照品溶液和样品溶液色谱图如图1 所示。

图1 混合对照品溶液和样品溶液色谱图

2.5 线性方程与检出限

精密吸取1.2 中的混合对照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按1.4 色谱条件分别进样测定，以待测化合物的质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，计算线性方程和相关系数。

将1.2 中的混合对照品溶液用50%甲醇溶液逐级稀释，在1.4 色谱条件下测定，以3 倍信噪比对应的质量浓度作为检出限，以10 倍信噪比对应的质量浓度作为定量限。7 种待测成分的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表1。

表1 7 种化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

由表1 可知，7 种待测化合物在各自的质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999，方法的检出限和定量限均满足鱼腥草芩蓝合剂中7 种化合物的检测需要。

2.6 稳定性试验

取鱼腥草芩蓝合剂样品，按照1.3 样品处理方法制备样品溶液，分别在配制完成后第1、2、4、8、12、24 h 进样，测定各待测化合物的色谱峰面积。绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.78%、0.81 %、0.74%、0.93%、1.21 %、1.01%、1.22%，表明样品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 精密度试验

取鱼腥草芩蓝合剂样品，按1.3 方法平行制备6份样品溶液，在1.4 色谱条件下分别进样测定，计算绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素的质量浓度，结果见表2。

表2 精密度试验结果

由表2 可知，绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素测定结果的相对标准偏差为1.23%～1.76%，表明该方法精密度较好，满足测定要求。

2.8 加标回收试验

精密量取6 份鱼腥草芩蓝合剂样品各1 mL，分别精密加入绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素单标储备液各1.0、1.0、2.0、0.2、5.0、0.2、0.5 mL，按照1.3 样品处理方法制备加标样品溶液，在1.4 色谱条件下分别进样测定，计算样品加样回收率，结果见表3。

表3 加标回收试验结果

由表3 可知，样品加标平均回收率为在98.17%～101.48%，表明该方法准确性良好。

3 结语

建立了高效液相色谱法同时测定鱼腥草芩蓝合剂中绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、槲皮苷、汉黄芩苷、槲皮素和汉黄芩素含量的方法。所测7 种成分涉及4 种药材中的活性成分，涵盖了多类指标成分，包括2 种苯丙素和5 种黄酮，为鱼腥草芩蓝合剂的质量控制提供了参考方法。