血清外泌体对乳腺癌细胞生物学行为的影响*

刘 奕，刘 静#，杨若妤#，谢彬彬，黄光瑜，刘凤玲，连慧琳，熊 灏，曾麒燕,3△

（1.广西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，南宁 530021；2.广西卫生职业技术学院医技系，南宁 530021；3.广西高校生物分子医学研究重点实验室，南宁 530021）

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,也是导致肿瘤相关死亡的主要原因[1]。乳腺癌的主要治疗手段包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗等多种辅助治疗为一体的治疗方式[2]。治疗方案的进步使乳腺癌患者的总体5年生存率得到明显的提高，然而，对于远处转移乳腺癌患者来说，5 年生存率仅有24.3%[3]。此外，长期用药引起的耐药性仍然是乳腺癌患者治疗失败和死亡的主要因素，大多数晚期乳腺癌患者不可避免地会产生耐药性[4]。近年来，作为细胞交流联系的载体—外泌体（Exosomes），被认为参与肿瘤化疗的耐药形成过程[5]。有学者认为，外泌体可能通过在肿瘤基质和耐药细胞、耐药细胞和非耐药细胞间传递各种耐药相关因子，改变肿瘤微环境来促进肿瘤耐药的发生，但其分子机制仍不清楚。

外泌体是由细胞主动分泌的拥有脂质双分子层的直径约为30～100 nm 的纳米级囊泡小体。外泌体被认为是细胞间通讯重要的工具，可携带多种细胞调节性RNA，包括miRNA、sncRNA 和siRNA，通过转运、内吞进入靶细胞，参与细胞间信息交流，在多种生理和病理过程中发挥重要作用，并且广泛参与肿瘤新生血管形成、侵袭、转移和免疫逃逸等过程[6]。诸多体内、外研究表明，外泌体能抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，并促进细胞凋亡[7]。Milman 等[8]还发现外泌体可逆转肿瘤细胞对化疗药的敏感性，并介导靶细胞自分泌和旁分泌信号传导。Romagnoli 等[9]发现树突状细胞来源的外泌体能增强激活T 细胞以获得更有效免疫应答的能力。相反，也有研究表明外泌体能促进肿瘤恶性进展以及导致化疗耐药的产生[10]。乳腺癌患者血清来源外泌体对乳腺癌的发生发展还尚未完全明确。本研究将分析乳腺癌血清来源外泌体对乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡、耐药的影响，以期为乳腺癌的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人乳腺癌细胞MCF-7 购自中国科学院上海分院。

1.1.2 主要试剂与耗材

总RNA 提取试剂盒购自Omega 公司；柏精超微量核酸蛋白分析仪购自上海漾盟仪器有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒、TB GreenTM Premix ExTaqTM 试剂盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒购自TaKaRa 公司。DMEM培养基（美国GIBCO公司），胎牛血清（美国GIBCO 公司），CCK8（东仁化学科技有限公司），FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD Pharmingen），6孔板和96孔板（CORNING公司）。

1.2 方法

1.2.1 样本收集

收集广西医科大学第一附属医院确诊的乳腺癌患者血清标本（疗效良好6例和耐药患者3例，下文所谓外泌体，若没标注耐药患者，均来自疗效良好的乳腺癌患者），所有样本采集均征得患者及其家属知情同意，且经广西医科大学伦理委员会批准。

1.2.2 外泌体的提取

将6 mL血清以500 g离心10 min，弃沉淀，于上清液中加入PBS 缓冲溶液至12 mL，2 000 g 离心30 min后，将上清液转移至离心管，4 ℃，20 000 g离心30 min。继续将上清液至另一离心管，4 ℃，110 000 g 下再次离心80 min。弃去上清液，加9 mL PBS 缓冲溶液缓慢重悬沉淀，并用用0.22 μm滤器过滤除菌，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 外泌体的鉴定

1.2.3.1 透射电子显微镜观察 取10 μL 外泌体悬液，滴于电镜铜网上，室温静置1 min，用乙酸铀酰负染15 s，置于滤纸上晾干，用透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小。

1.2.3.2 外泌体的粒径分析 用1 mL PBS 缓冲溶液重悬外泌体，将悬液注入样品池，用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS粒径检测仪检测外泌体的粒径大小。

1.2.3.3 流式细胞术 用PBS 缓冲溶液重悬外泌体，分别进行CD63 抗体和CD81 抗体染色，用流式细胞仪检测外泌体的表面标志CD63 和CD81 的表达情况。

1.2.3.4 蛋白印迹法 在外泌体中预先加入蛋白酶抑制剂（100×苯甲基磺酰氟），100×cocktail和磷酸酶抑制剂，后取 50 μL 外泌体加入等量裂解液在冰上裂解15 min，4 ℃，13 000 g，离心10 min 后取上清，利用BCA 法进行蛋白定量，同时将上清进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、脱脂奶粉封闭、抗体孵育和显色，最后通过凝胶成像系统观察CD9、TSG101和HSC70的表达情况。

1.2.4 细胞培养

乳腺癌细胞株MCF-7用含10%胎牛血清和1%青—链霉素的DMEM 培养基于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续研究。

1.2.5 增殖实验

将MCF-7细胞以5×103/孔接种于96 孔板，以未处理MCF-7 细胞为对照组，实验组加入外泌体（终浓度为20 μg/mL,培养箱中培养。培养一定时间后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养细胞2 h 后，检测OD450nm，以此反映细胞增殖能力。

1.2.6 划痕实验

将MCF-7 细胞以5×105个/孔接种于6 孔板，以未处理MCF-7 细胞为对照组，实验组加入外泌体（终浓度为20 μg/mL,培养24 h 后，用小枪头在孔中划线，保持划法一致均匀。PBS洗去脱落细胞后，加入完全培养基。培养24 h 或48 h 后拍照，并用Image J 软件分析划痕愈合距离。

1.2.7 流式细胞术

收集与外泌体共孵育48 h 后的细胞，用预冷PBS洗涤后，加入Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）（0.5 μg/mL），15 min后，加入碘化丙啶（5 μg/mL），上流式细胞仪分析细胞凋亡率，以未处理MCF-7细胞为对照组。

1.2.8 药物敏感性分析

将MCF-7 细胞以5×103/孔接种于96 孔板，以Taxo或阿霉素单纯用药组为对照组，实验组加入外泌体（终浓度为20 μg/mL）,培养24 h后，加入阿霉素（Adriamycin,Adr，0.4 μg/mL）或Taxol（10 μg/mL），培养一定时间后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养细胞2 h 后，检测OD450nm，并计算细胞生长抑制率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体鉴定

外泌体在透射电子显微镜下显示呈茶托状，直径约70 nm（图1A）；粒径分析结果显示，样本平均粒径为为38.17 nm，分布系数为0.477 PDI，粒径主峰为71.26 nm，粒径20～200 nm，百分比为76.2%（图1B）；流式细胞术检测CD63 阳性率为77.4%，CD81 阳性率为91.8%（图2A）；蛋白质印迹法可检测到CD9、TSG101及HSC70的表达条带（图2B）。

图1 血清外泌体形态观察及粒径分析

图2 血清外泌体特异性蛋白标志物的检测

2.2 乳腺癌患者血清来源的外泌体抑制MCF-7 细胞的增殖

与对照组相比，实验组的MCF-7 细胞A450值明显降低（P＜0.05），表明外泌体明显抑制MCF-7 细胞的增殖能力（图3）。

图3 血清外泌体可抑制MCF-7细胞的增殖

2.3 乳腺癌患者血清来源的外泌体抑制MCF-7 细胞的迁移

实验组的MCF-7 细胞的24 h 和48 h 的划痕愈合率分别为（17.78 ± 2.35）%和（34.88 ± 3.12）%，而对照组24 h和48 h划痕愈合率分别为（27.51±3.02）%和（46.7±7.25）%，两组比较，实验组细胞的愈合率明显降低（P＜0.01，P＜0.001），提示外泌体可抑制MCF7细胞的迁移能力，见图4。

图4 血清外泌体可抑制MCF-7细胞的迁移

2.4 乳腺癌患者血清来源的外泌体诱导MCF-7 细胞凋亡

对照组和实验组细胞凋亡比例分别为5.53%和10.03%，实验组细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05），提示外泌体可诱导MCF-7细胞凋亡，见图5。

图5 血清外泌体可诱导MCF-7细胞凋亡

2.5 乳腺癌患者血清来源的外泌体增强MCF-7 细胞对阿霉素的敏感性

如图6A所示，单纯阿霉素（Adr）处理组的细胞增殖抑制率为48.5%，当阿霉素分别与来自3 位疗效良好的乳腺癌患者血清的外泌体共同作用（Adr+Exo）后，增殖抑制率分别为87.9%、90.5%和88.9%，与单纯阿霉素处理组相比，抑制效果明显升高（P＜0.01）。同时将外泌体与Taxol共同作用（Tax+Exo），发现抑制效果并没有明显提高（见图6B）。从3 位耐药患者血清中分离出外泌体（Exo耐），发现与单纯阿霉素处理组相比，Exo耐与阿霉素联合作用（Adr+Exo耐）可明显降低细胞增殖的抑制率（P＜0.01，图6A）；类似地，与单纯Taxol处理组相比，Exo耐与Taxol 联合作用（Adr+Exo耐）也可明显降低细胞增殖的抑制率（P＜0.05，图6B）。从健康人血清中分离的外泌体（Exo健康）与阿霉素或Taxol 联合作用与单纯化疗药处理相比，抑制率无明显变化（均P＞0.05）（图6A和图6B）。

图6 血清外泌体影响MCF-7细胞对化疗药的敏感性

3 讨论

外泌体的分离方法包括超速离心法、密度梯度离心法、聚乙二醇沉淀法、免疫磁珠分离法等。超速离心法是目前认为分离外泌体的经典方法，操作简单，但需要样本量较大且得率较少；密度梯度离心法需要控制合适的离心时间，否则相似密度的污染颗粒可混在外泌体中；聚乙二醇沉淀法存在非囊泡污染物（如脂蛋白），而且聚乙二醇混杂可能会影响下游分析；免疫磁珠分离法不适合从大量样本中分离外泌体。王婷婷等[11]发现，血清较血浆中外泌体数量略高，故本研究选择超速离心法分离血清外泌体。目前对于外泌体的鉴定主要有透射电镜观察形态、粒径分析、免疫印迹或流式分析特异蛋白等。本研究中，透射电镜观察到的外泌体大小与粒径测定结果相符，约100 nm 左右，外泌体形态呈茶托状，具有双层膜包裹的囊性结构，这与文献[12]报道一致。外泌体特异性表达CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、TSG101、HSC70等分子，本研究选择了CD9、CD63、CD81、TSG101 和HSC70 进行检测，结果显示，它们在外泌体样本中的表达丰度较高，说明所提外泌体符合要求且纯度较高，能满足后续研究的要求。

目前研究认为外泌体介导的信号传导主要有以下3 种途径：通过受体与靶细胞相互作用、直接与靶细胞无选择性融合以及靶细胞的内吞作用。外泌体通过将其内含物传递到靶细胞，影响细胞内各种生理病理过程，如调控炎症[13]、跨越血脑屏障[14]、血管生成[15]、肿瘤形成、生长、侵袭、转移、耐药等过程[16-17]。研究发现，乳腺癌细胞通过外泌体双调蛋白(AREG)与细胞表面表皮生长因子受体结合，可活化EGFR 通路，促进细胞增殖和侵袭，并抑制细胞凋亡。Sun等[18]报道荷瘤小鼠的骨髓来源树突状细胞的外泌体通过PD-L1 抑制自身CD8+T 细胞的增殖和活化，导致免疫耐受并促进肿瘤转移。Yang等[19]研究表明，乳腺癌细胞来源的外泌体通过miR-146a/TXNIP轴激活Wnt通路，促进正常成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转变，进而促进上皮间转化和乳腺癌细胞的侵袭和转移。Kannan 等[20]发现，外泌体中的SH3GL2 和MFN2 对乳腺癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学行为可能具有抑制作用。本研究发现，从治疗效果良好的乳腺癌患者血清中分离的外泌体可抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移，并诱导凋亡，但其分子调控机制有待进一步研究。

肿瘤微环境在调控肿瘤细胞对药物敏感性方面发挥着重要作用。肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）作为乳腺癌微环境中主要的基质细胞，CAFs 与肿瘤细胞密切接触，且存在大量的动态信息交互，可通过分泌细胞因子、外泌体等方式影响乳腺癌的疗效。在乳腺癌中，外泌体microRNAs 如miR-21、miR-30c、miR-222、miR-451、miR-489、miR-155已被证实参与耐药形成[21]，但具体机制尚不明确。乳腺癌耐药细胞来源的外泌体高表达UCH-L1 蛋白和miR-221-3p，可激活MAPK／ERK 信号通路上调PgP 蛋白的表达或PI3K/AKT 信号通路，从而向受体细胞传递耐药性[22]。本研究从治疗效果良好的乳腺癌患者血清中分离的外泌体可增加乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性，但对Taxol的敏感性无影响，相反从乳腺癌耐药患者血清中分离的外泌体则降低乳腺癌细胞对阿霉素和Taxol 的敏感性，提示来自不同疗效的患者血清外泌体对于乳腺癌对化疗药敏感性的效果是不同的，其中可能涉及不同疗效患者外泌体中的不同RNA 和蛋白质所介导的不同信号通路，因而在后续的研究中有必要对疗效良好患者和耐药患者的外泌体进一步鉴定其中的差异RNA和蛋白质，以探明乳腺癌的耐药机制，为逆转乳腺癌耐药提供基础。

综上所述，通过对乳腺癌患者血清来源的外泌体进行提取和鉴定，结果表明，这些外泌体可调控乳腺癌细胞的增殖、迁移、凋亡以及对化疗药的敏感性，但其中的分子调控机制有待进一步深入研究。