参麦注射液促进心肌梗死模型大鼠心肌血管新生

曾玉玲，李世阁, 占德进

(宁德师范学院附属宁德市医院 心血管内科， 福建 宁德 352100)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是心肌急性、持续性缺血缺氧引发的心肌坏死，发病率、病死率均较高[1]。目前该病治疗以静脉溶栓及冠状动脉介入术、搭桥术为主，但多数因冠状动脉弥漫性病变、多器官功能衰竭等原因未能在有效时间窗内接受再灌注治疗，延误病情[2]。血管新生可增加心肌血流量，建立侧支循环，改善缺血症状，故治疗性血管新生已成为治疗该病的重要目标[3]。参麦注射液(Shenmai injection)可养阴生津、益气固脱，已有研究证实其在MI中的功效[4]，但关于其对该病心肌血管新生的促进作用及相关机制尚不明确。本研究建立MI大鼠模型，观察参麦注射液促进该病心肌血管新生的作用，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料：SPF级SD雄性大鼠65只，8周龄，体质量(230±20)g[中国科学院上海药物研究所，使用许可SYXK(沪)2019-0032]。

1.1.2 药物、主要试剂：参麦注射液(云南植物药业有限公司)；依那普利片剂(江苏常州制药厂有限公司)；血管性假血友病因子(von Willebrand Factor,vWF，vWF)一抗、兔抗山羊IgG二抗、小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)单抗、山羊抗小鼠荧光二抗(上海研启生物科技有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher Scientifical公司)；兔抗大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatei-dylinositol 3 kinase，PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)、p-AKT、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)单抗，山羊抗兔IgG二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：65只大鼠中随机选取55只以冠状动脉结扎法建立MI模型[5]。麻醉后切开颈部气管，连接呼吸机，至呼吸频率80次/min后开胸。左侧胸骨旁5 mm斜切，左前胸廓旁第4肋间开胸，暴露心脏，开胸器固定，分离心包，向下轻按心脏，6～0号丝线穿过左心耳与肺动脉圆锥交界，左冠状动脉前降支近端结扎。结扎瞬间左心室前壁光泽消失变为暗灰色，结扎远端心肌收缩力减弱或消失即为造模成功。41只建模成功且存活大鼠随机分为模型组、低和高剂量组，各10只、阳性组11只。其余10只均经历上述手术过程，但丝线从冠状动脉下穿过不结扎。术后腹腔注射青霉素。参麦注射液临床肌内注射用量2～4 mL/次，根据人、大鼠体表面积比例换算为等效剂量0.21～0.42 mL/kg，结合前期实验及相关文献确定低、高剂量组用量为1、2 mL/kg[6]，术后第2天用5%葡萄糖溶液稀释，5 mL/kg腹腔注射，同时0.9%氯化钠溶液5 mL灌胃；阳性组用依那普利片剂干预[7]，根据人、大鼠的体表面积比例换算为等效剂量2 mg/kg，溶于0.9%氯化钠溶液5 mL灌胃，同时5%葡萄糖溶液5 mL/kg腹腔注射；假手术组、模型组5%葡萄糖溶液5 mL/kg腹腔注射，同时0.9%氯化钠溶液5 mL灌胃。1次/d。连续2周。

1.2.2 HE染色观察心肌组织病理变化：末次腹腔注射后4 h每组脱颈处死10只大鼠，迅速分离、切除心肌组织。每组5只心肌组织用40%多聚甲醛固定，病理切片机连续切片，HE染色，显微镜下观察心肌病理变化，其余5只心肌组织冷冻保存。

1.2.3 免疫组织化学染色观察梗死周围区毛细血管密度：取心肌组织切片，滴加vWF一抗、兔抗山羊IgG二抗。DAB染色，苏木精复染，倒置相差显微镜拍照，随机选取5个视野，计算每个视野毛细血管数目。

1.2.4 免疫荧光染色观察梗死周围区小动脉密度：取心肌组织切片，滴加a-SMA一抗、山羊抗小鼠荧光二抗。DAB染色，苏木精复染，倒置相差显微镜拍照，随机选取5个视野，计算每个视野小动脉数目。

1.2.5 Western blot检测各组PI3K、AKT、p-AKT、VEGF蛋白表达量：取心肌组织，裂解液裂解，BCA法定量蛋白，取测样本与等量上样缓冲液混合，SDS-PAGE分离，转膜，封闭2 h，加兔抗大鼠PI3K、AKT、p-AKT、VEGF一抗，4 ℃过夜，加山羊抗兔IgG二抗，室温孵育1 h，暗室显影，以目的条带与β-actin吸光度(A)值比值表示蛋白表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况

模型组拱背站立，呼吸急促，容易激惹，对外界刺激敏感，毛色发黄且蓬松竖立，低、高剂量组、阳性组经干预有所改善。

2.2 心肌组织病理变化情况

模型组心肌细胞排列紊乱，明显肥大，嵴变宽；低和高剂量组，阳性组心肌细胞排列较为致密、整齐，细胞核为椭圆形，嵴间隙变窄，阳性组改善最为明显，其次为高剂量组，最后为低剂量组(图1)。

2.3 MI周围区毛细血管密度

与假手术组比较，模型组毛细血管、小动脉密度均增加(P<0.05)；与模型组比较，低和高剂量组、阳性组毛细血管、小动脉密度均进一步增加(P<0.05)(图2～3，表1)。

表1 MI区毛细血管密度

2.4 PI3K、VEGF蛋白表达量及p-AKT/AKT

与假手术组比较，模型组PI3K、VEGF蛋白表达量，p-AKT/AKT均升高(P<0.05)，与模型组比较，低剂量组、高剂量组、阳性组均进一步升高(P<0.05)(图4，表2)。

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E.positive group图1 心肌组织病理变化(HE染色)Fig 1 Pathological changed of myocardial tissue(scale bar=150 μm)

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E. positive group图2 免疫组织化学染色检测各组心肌组织vWF表达

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E. positive group图3 免疫荧光染色检测各组心肌组织α-SMA表达

表2 PI3K、VEGF蛋白表达量及p-AKT/AKT比较

A.sham operation group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group; E.positive group图4 Western blot检测各组心肌组织PI3K、AKT、p-AKT、VEGF蛋白表达Fig 4 Western blot analysis of PI3K, AKT, p-AKT, VEGF protein expression in myocardial tissues in each group

3 讨论

MI是常见心血管系统疾病，临床认为其发病机制与脂类代谢、炎性反应、斑块血流动力学及血小板等因素互相作用，导致不稳定冠状动脉斑块破裂有关[8]。MI面积、心功能改变、心室重构程度与梗死区域血管新生、侧支循环关系密切。血管新生可改善心肌缺血，避免缺血钝抑性心肌坏死及凋亡，并可增加正常心肌细胞供氧，抑制心肌细胞代偿性肥大后的凋亡，产生再生性代偿。

本研究显示，低和高剂量组，阳性组病理变化改善效果依次增强，MI周围区毛细血管、小动脉密度依次增加，提示参麦注射液可改善MI大鼠病理变化，促进心肌血管新生，且呈剂量依赖性。参麦注射液由红参与麦冬制成，可滋阴生津、救逆固脱、益气复脉。现代药理学证实[9]，参麦注射液中有效成分人参皂苷及麦冬多糖可增强心肌收缩力及缺氧耐受力，增加冠状动脉血流量，并促进ATP合成，实现心肌缺血再灌注，同时拮抗自由基氧化。有学者研究显示[10]，参麦注射液可改善MI大鼠心功能，减轻心肌纤维化程度，本研究结论与其相似。

PI3K是一种对磷脂酰肌醇D3位的脂类激酶，AKT是其信号通路下游关键效应分子，磷酸化后可进入胞质与胞核中，发挥促细胞增殖、拮抗凋亡等级联反应。VEGF是血管内皮细胞的促有丝分裂剂，在血管新生过程中起到重要作用。有研究指出[11]，PI3K/AKT信号通路可能通过抑制心肌细胞凋亡、介导血管生成、促进细胞能量代谢等方面参与MI发病进程。本研究显示阳性组、高和低剂量组的PI3K、VEGF表达依次降低，提示参麦注射液促进MI血管新生可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。

综上所述，参麦注射液可促进MI大鼠心肌血管新生，且呈剂量依赖性，推测与激活PI3K/AKT信号通路有关。