西南地区类风湿性关节炎患者Fas单核苷酸多态性与血清sFas水平相关

程晓刚，金 虹，陈 玮，罗 丹，单 娟，徐 艳

(成都医学院 免疫学教研室， 四川 成都 610500)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种临床常见的风湿免疫顽疾，RA的发病与淋巴细胞和组织细胞细胞凋亡异常有关联[1-3]。自杀相关蛋白(factor associated suicide，Fas)为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员，主要表达于激活的T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞等细胞表面，研究表明Fas介导的细胞凋亡与多种自身免疫病的发生发展相关。Fas多态性与系统性红斑狼疮、干燥综合征等自身免疫病相关[4-7]，并伴有血清可溶性Fas(soluble Fas，sFas)水平增高[7-8]。RA患者外周血存在sFas表达水平增高[2]，但其与Fas多态性的相互关系尚不清楚，且Fas多态性对RA的发生发展的影响尚未完全明确。本研究旨在采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)对类风湿性关节炎患者与健康对照组Fas单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphison,SNP)位点的多态性进行分析，并分析RA患者和健康人群外周血sFas水平，探索RA患者sFas水平与Fas多态性的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017年3月1日至2019年9月30日期间前来成都医学院附属医院确诊的类风湿性关节炎患者183例，其中男性59例，女性124例，年龄22～68岁，平均(43.6±11.9)岁。所有病例均符合美国风湿病协会(American Rheumatism Association，ARA)1987年修订的RA诊断标准。患者的年龄、性别等详细信息均从医疗记录检索，排除伴有其他自身免疫病等疾病。对照组采用同时期年龄和性别相匹配的健康人群195名，其中男性68名，女性127名，年龄21～72岁，平均(45.1±10.2)岁。对照组人群在1周内无发热或接受任何药物治疗，无怀孕、恶性肿瘤、慢性炎性疾病或结缔组织疾病等慢性病史。RA组与健康对照组的性别、年龄、民族、类风湿因子等指标差异均无统计学意义。所有样本均来自生活在西南地区的人群，该研究获得成都医学院医学伦理委员会批准(2017-006)，所有研究对象均知情同意。

全外周血基因组DNA提取试剂(北京百泰克生物技术公司)；DNA聚合酶(北京天根生化科技公司)；限制性内切酶(New England Biolabs公司)。引物由华大公司合成，sFas ELISA试剂(Biosource公司)，操作严格按照说明书进行。

1.2 方法

1.2.1 PCR-RFLP检测Fas多态性:全外周血基因组DNA提取试剂提取样本DNA，PCR-RFLP检测Fas多态性。PCR反应条件：100 ng基因组DNA、0.2 μmol/L dNTP、上下游引物各0.5 μmol/L(Fas-670A/G，上游引物：5′-CTACCTAAGAGCTATCTA CCTTC-3′，下游引物：5′-GGCTGTCCATGTTGTGGCT GC-3′；Fas-1 377G/A上游引物：5′-TGTGTGCACAA GGTGGCGC-3′，下游引物：5′-TGCATCTGTCACTG CATTACCACCA-3′)、2.0 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Tris HCl(pH=8.8)、2.5 U DNA聚合酶，总体积25 μL。反应温度：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性30 s，退火30 s(Fas-670 A/G为56 ℃、Fas-1 377 G/A为55 ℃)，72 ℃延伸1 min，循环35次后，72 ℃延伸 10 min。PCR产物经限制性内切酶(Fas-670 A/G为MvaⅠ(37 ℃ 5 h)，Fas-1 377 G/A为BstUⅠ (60 ℃ 4 h)，2.5%琼脂糖凝胶电泳。随机抽取20%的样本和对照，基因测序验证其正确性。

1.2.2 ELISA检测外周血sFas蛋白水平:抽取类风湿性关节炎患者与健康对照人群每种基因型17～50例/名外周血5 mL，静置后分离血清，用ELISA试剂盒检测类风湿性关节炎与健康对照组外周血sFas水平，测试步骤严格按照试剂说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 测序验证PCR-RFLP实验结果

随机分别选取40例RA患者和健康对照者样品的PCR产物进行测序验证，结果与PCR-RFLP结果完全一致(图1)。

A.-1 377 AA genotyping；B.-1 377 GA genotyping；C.-1 377 GG genotyping； D.-670 GG genotyping； E.-670 AG genotyping； F.-670 AA genotyping

2.2 类风湿性关节炎患者组与健康对照组Fas多态性无显著性差异

RA患者组和健康对照组的各基因型均处于Hardy-Weinberg平衡状态。Fas-1 377G/A和A/A型和-670G/G纯合子变异在RA患者比健康对照组更常见，但与健康对照组相比，类风湿性关节炎患者Fas多态性差异无统计学意义，年龄与性别调整的回归分析，亦无差异(表1)。

表1 类风湿性关节炎患者与对照组Fas多态性分析Table 1Fas polymorphisms in patients with RA and healthy controls

2.3 类风湿性关节炎患者组与健康对照组Fas多态性单倍型组合频率分析

Fas-1 377G/A和-670A/G启动子多态性的4种不同单倍型的组合：Fas-1 377G与-670A(GA)，-1 377G与-670G(GG)，-1 377A与-670G(AG)和-1 377A与-670A(AA)的单体型组合频率在RA患者组与健康对照组差异均无统计学意义(表2)。

表2 类风湿性关节炎患者组与对照组Fas -1 377/-670基因多态性单倍型频率分析Table 2 Association between Fas -1 377/-670 haplotypes in patients with RA and healthy controls

2.4 类风湿性关节炎患者组与健康对照组外周血sFas蛋白水平检测

RA患者外周血血清sFas蛋白平均水平为(2.54±0.41)ng/mL，显著高于健康对照组的(1.57±0.36)ng/mL(P<0.01)，比较健康对照组各基因型相对应的sFas水平，未发现sFas和Fas各基因型之间有显著关联，但RA组Fas-670 G/G纯合子型患者的sFas平均水平为(2.37±0.29)ng/mL，比A/A型患者的(2.64±0.33)ng/mL较低(P<0.05)(表3)。

表3 类风湿关节炎患者组和健康对照者外周血sFas水平Table 3 sFas level in peripheral blood of patients with RA and healthy controls

3 讨论

Fas为肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，主要表达于激活的T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞等细胞表面，Fas与其配体FasL(Fas ligand)结合可促使表达Fas的细胞凋亡。Fas mRNA通过不同剪切方式可分别产生膜表面Fas和血清可溶性Fas(sFas)，因此血清中sFas水平与Fas基因表达水平呈正相关，血清sFas水平可反映出细胞膜表面Fas水平。由于Fas的多态性不同，细胞膜表面Fas水平也有所差异，细胞膜表面Fas表达降低可引起淋巴细胞失衡、免疫机能紊乱、自身免疫耐受的失控而诱发自身免疫病[1-3]。

研究发现了Fas多态性与包括系统性狼疮在内的自身免疫性疾病之间的关系，如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、多发性硬化、原发性干燥综合征，格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrom, GBS)等[4-9]。实验结果显示Fas-1 377(rs2234767)G/A和-670(rs1800682)A/G的多态性在健康对照组和RA患者组无显著差异，因此Fas-1 377 G/A和-670 A/G多态性与RA疾病的发生似无显著关联，本实验与某些相关文献报道一致[10-11]，但也有不同[12]，其原因可能与实验人群的地区分布、取样差别及检测人群的规模等有关。本实验发现RA患者与健康者相比，血清sFas水平有显著升高，且RA患者携带有Fas-670G/G基因型者较Fas-670A/A基因型者具有较低的血清sFas水平。相关研究也表明Fas启动子区-670位A/A基因型较G/G基因型有超3倍的结合STAT1的能力，因此γ-干扰素(IFN-γ)可通过激活STAT1促进由Fas-670位A/A基因型受试者而非G/G基因型的受试者分离的单核细胞的Fas表达，在同时使用3种改善病情的抗风湿药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)治疗的RA患者中更常伴随有Fas-670G/G纯合体基因型，且血清中的抗CCP抗体增多[10]。结合实验结果，认为sFas水平与Fas-670位基因多态性有一定关系，Fas-670G/G基因型会影响血清sFas及细胞表面Fas表达水平，进一步干扰细胞凋亡从而参与RA的发病进程或影响疾病的严重程度，因此认为RA患者在炎性和细胞因子等刺激下，细胞Fas表达增加可诱导淋巴细胞和多种组织细胞凋亡，但Fas-670G/G纯合体基因型由于影响了Fas表达，淋巴细胞和组织细胞凋亡受阻因而可以促进类风湿性关节炎的病情。综上所述Fas-1 377 G/A和-670 A/G多态性似与RA的发生无显著相关性，但-670 G/G基因型可通过影响Fas表达从而影响疾病的发展。

本研究尚存一定缺陷：如类风湿性关节炎组和对照组样本数相对较少；环境因素没有纳入观察范围，没有进行基因多态性与环境相互作用的分析；未将其他生化指标纳入检测范围等。因此需在来自不同地理区域的更大样本数的人群中进行深入研究，以进一步阐明环境因素与类风湿性关节炎发生发展及Fas多态性之间复杂的相互作用。

志谢：感谢成都医学院附属医院相关科室提供样本及病历资料。