HIF-1α激动剂或拮抗剂对脓毒症大鼠肠道黏膜通透性的影响

王玉龙，滕文彬，单 跃，姚刘旭，何 锐，李玉红，祝胜美*

(1.浙江大学医学院附属第一医院 麻醉科， 浙江 杭州 310000； 2.绍兴市人民医院 麻醉科，浙江 绍兴 312000；3.树人大学树兰国际医学院附属树兰(杭州)医院 麻醉科， 浙江 杭州 310004)

脓毒症(sepsis)是机体对感染反应失调导致的危及生命的器官功能障碍[1]，是一个公认的全球健康问题，严重威胁人类生命安全。2017年全球统计数据显示[2]，sepsis年发病例4 890万例，死亡病例约110万例，死亡率为19.7%；拯救sepsis运动指南为临床管理sepsis患者提供一些列循证医学建议，在sepsis发病机制方面仍然存在很多认识空白[3]。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)是人体对适应低氧环境的关键转录因子，在急性低氧反应中发挥关键作用[4]。近年来，肠功能障碍对sepsis结局的影响受到研究者重点关注。Sepsis早期肠上皮细胞低氧能量障碍是肠功能障碍重要诱因，机体可能通过上调HIF-1α，促进能量代谢，改善脓毒性肠道黏膜屏障(intestinal mucosal barrier,IMB)损伤，二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxallyl glycine, DMOG)是脯氨酰羟化酶的抑制剂，可以抑制脯氨酰羟化酶从而上调HIF-1α表达；而拮抗剂BAY87-2243作用相反，下调HIF-1α表达。本研究旨在探索HIF-1α激动剂DMOG或拮抗剂BAY87-2243对脓毒症大鼠肠道黏膜通透性作用。为sepsis肠道黏膜屏障功能损伤救治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选择SPF级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠24只，200～250 g[浙江省医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK (浙)2-14-0001]。研究方案经过绍兴市人民医院动物伦理委员会议讨论通过(伦理审批文号：2020-009)。

1.1.2 主要试剂和设备：二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)和肠型脂肪酸结合蛋白2(intestinal type fatty acid binding protein 2, I-FABP/FABP2)试剂盒(Cloud-Clone公司)；D-乳酸(D-lactic)试剂盒(Abebio公司)；荧光素标记的右旋糖苷(fluorescein isothiocyanate-dextran, FD4)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma-Aldrich公司)； HIF-1α、ZO-1(zonula occludens-1)、occludin、claudin-1和GAPDH一抗(Abcam公司)；二甲基乙二酰基甘氨酸(dimethyloxaloylglycine,DMOG)和BAY87-2243(MedChemExpress公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的山羊抗兔IgG(Jackson公司)。SpectraMax Plus全波长酶标仪(上海美谷分子仪器有限公司)；ChemiDoc XRS凝胶成像系统和Quantity one 4.6图像处理与分析系统(Bio-Rad公司)；R510IP小动物麻醉机(深圳瑞沃德公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组及处理：将大鼠随机数字法分为sham组(n=6)、sepsis组(n=6)[用盲肠结扎穿孔(ligation and perforation, CLP)]、(sepsis+DMOG)组(n=6)[CLP术前连续7 d腹腔注射DMOG(40 mg/kg)]；(sepsis+BAY87-2243)组(n=6)[CLP术前连续3 d灌胃BAY87-2243(9 mg/kg)]。

1.2.2 标本的采集与处置：大鼠采用七氟烷麻醉后，分离出4 cm小肠，用手术缝线分别结扎肠管两端，将50 μg的FD4，药物配制浓度为100 mg/mL，注入肠管内，1 h后取门静脉0.5 mL，用于测定FD4血浆浓度。之后取腹主动脉血2 mL，低温离心后分装置于-80 ℃保存，用于检测DAO、FABP2、D-lactic血浆浓度。距离盲肠部2 cm处取1 cm回肠组织数段，部分制成蜡块用于形态学研究；部分分装置于-80 ℃存储，用于检测肠黏膜紧密连接(tight junctions, TJs)和HIF-1α蛋白的表达。随后颈椎脱臼法处死大鼠。

1.2.3 HE染色检测大鼠肠黏膜形态学变化：常规HE染色光镜下观察小肠黏膜形态学改变，采用Chiu’s 评分定量判定小肠组织损伤程度。

1.2.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DAO、FABP2和D-lactic血浆浓度：按照ELISA试剂盒说明书检测各标本DAO、FABP2和D-lactic血浆表达水平。每个样本和标准品均设3个复孔，获得酶标仪450 nm处吸光值(A)，根据吸光值绘制标准曲线，计算各样本DAO、FABP2和D-lactic的含量，取平均值。

1.2.5 FD4浓度的测定：解冻后血浆作1∶8倍稀释，转移到96孔板，每个标本做个复孔，每个孔100 μL。用荧光酶标仪测定FD4血浆浓度。激发波长和发射波长分别设定为490 nm和520 nm。

1.2.6 Western blot测定小肠黏膜TJs和HIF-1α蛋白的表达： 具体操作步骤按常规方法进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HIF-1α激动剂或拮抗剂对sepsis大鼠肠黏膜病理形态的影响

Sham组大鼠肠黏膜完整，绒毛整齐(图1A)；Sepsis组膜黏膜完整性破坏，肠绒毛萎缩脱落；(sepsis+DMOG)组大鼠肠绒损伤程度介于sham组和sepsis组之间；而(sepsis+BAY87-2243)组绒毛损伤比sepsis组更严重，甚至出现溃疡。Chiu’s评分与黏膜损伤程度成正比，具体见图1A，B。

2.2 各组大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血浆的比较

与sham组相比，sepsis组大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD4血浆浓度均增高(P<0.05)(图2A～D)。与sepsis相比，(sepsis+DMOG)组DAO、FABP2、D-lactic和FD4血浆浓度均明显降低(P<0.05)(图2A～D)；(sepsis+BAY87-2243)组大鼠DAO、FABP2、D-lactic和FD-4血浆浓度均显著升高(P<0.05)(图2A，D)。

2.3 各组大鼠肠黏膜组织TJs和HIF-1α表达的比较

与sham组相比，sepsis组大鼠肠黏膜组织中HIF-1α的表达水平上调(P<0.05)(图3A，B)，而TJs蛋白(ZO-1、occludin和claudin-1蛋白)的表达水平明显下调(P<0.05)(图3A，C～E)。与sepsis相比(sepsis+DMOG)组肠黏膜组织中HIF-1α、ZO-1、occludin和claudin-1蛋白的表达均显著上调P<0.05)；而(sepsis+BAY87-2243)组相反，肠黏膜组织中上述蛋白表达水平均下调(P<0.05)(图3,表1)。

表1 HIF-1α激动剂或拮抗剂对大鼠肠黏膜HIF-1α和TJs蛋白表达的影响

A.images of intestinal morphology, the pathological status of intestinal mucosal barrier villi and lamina propria in the treated animals was shown at the arrow (HE staining,×200); B.intestinal mucosa injury was quantitative assessed by Chiu’s Score; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with sepsis group

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with sepsis group图2 HIF-1α激动剂或抑制剂对大鼠血浆DAO(A)、FABP2(B)、D-lactic(C)和FD4(D)的影响

3 讨论

Sepsis是一种危及生命的临床综合征，可导致自身组织和器官损伤，引起多个器官功能障碍[1]。危重患者肠道致病菌过度繁殖，肠黏膜受损，细菌毒素进入血循环，进而发展为全身性炎性反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)或多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，因此，肠道是sepsis的“启动器官”。Sepsis中，肠黏膜微循环障碍，肠道黏膜屏障受损；通过肠道-淋巴通路使肠功能衰竭进一步恶化，肠道又是sepsis的“中心器官”[5]。

DAO和FABP2在肠黏膜细胞中表达， 肠黏膜损伤细胞脱落时，快速释放进入血循环，可以作为肠黏膜损伤的特异性标志物[6]。D-lactic是肠道细菌的代谢产物， 肠黏膜损伤致通透性增加时，D-lactic入血，哺乳动物不能代谢D-lactic，因此，血D-lactic浓度增加间接反映肠道通透性增加[6]。FD4是肠道通透性和肠道屏障改变的标志物[7]。本研究中，sepsis大鼠上述血浆标志物均升高，提示sepsis导致大鼠肠黏膜损伤，通透性增加。

TJs是维系细胞间链接与细胞屏障的重要组成部分。Occludin维持肠道物理特性，具有黏附功能；claudin-1形成细胞旁离子的选择性通道，影响着细胞间物质渗透率[8]；ZO-1与多种细胞骨架蛋白绑定，对TJs起到支撑骨架作用[9]。本研究中，sepsis大鼠肠黏膜组织中TJs相关蛋白ZO-1、occluden、claudin-1的表达水平下降，病理形态破坏，提示sepsis导致大鼠肠黏膜形态结构破坏。

生理状态下，肠上皮细胞暴露于“生理性低氧”环境中，低氧环境是肠道共生菌生存的物质基础，并促进肠道物质运输[10]；炎性反应时，氧耗增加、血管收缩导致氧供降低，肠上皮细胞出现缺氧[11]。本研究中，sepsis大鼠肠黏膜中HIF-1α表达明显增加，明显高于正常组，提示sepsis造成肠黏膜细胞缺氧，黏膜细胞通过自身代偿性HIF-1α的表达上调，以提高对缺氧的耐受并促进增殖维护肠道黏膜屏障的完整。既往研究使用HIF-1α激活剂明显减轻CLP引起小鼠肾脏损害[12]。在结肠炎小鼠中，HIF-1α激活剂AKB-4924能增强小鼠肠黏膜屏障功能，但是对HIF-1α缺陷小鼠无肠黏膜保护作用，表明肠黏膜HIF-1α是AKB-4924介导保护的组织靶点[13]。肠道HIF-1α敲除小鼠加剧肠酒精性肠道黏膜屏障的破坏[14]。通过敲除和过表达实验发现HIF在基因启动子水平上对claudin-1的表达起着基本的调节作用，揭示claudin-1可能是HIF的一个重要靶基因，HIF缺陷型肠黏膜claudin-1表达异常，导致TJs形态异常[15]。本研究中给予sepsis大鼠DMOG，sepsis大鼠肠道HIF-1α和TJs相关蛋白的表达上调，肠道黏膜损伤缓解。而给予BAY87-2243，出现HIF-1α和TJs相关蛋白表达下调，肠黏膜损伤缓解加重。

A.expression bands; B-E.protein expression of HIF-1α, ZO-1, occudin, and claudin-1; *P<0.05 compared with sham; #P<0.05 compared with sepsis

综上所述，sepsis时大鼠肠道黏膜屏障的结构和功能受到严重破坏，黏膜细胞通过自身调节HIF-1α表达上调。给予HIF-1α激动剂DMOG通过降低肠黏膜通透性，调节TJs中claudin-1而发挥保护肠道黏膜屏障作用，缓解脓毒引起的肠道黏膜屏障损伤作用；而给予HIF-1α抑制剂BAY87-2243，作用相反。结果提示HIF-1α对sepsis大鼠通过降低肠黏膜的通透性，发挥对脓毒症肠黏膜损伤具有保护作用，具体机制有待于进一步探索。