地黄药材的红外指纹图谱及多元统计分析

张维方，樊克锋，雷敬卫*，纪 亮

1.河南中医药大学药学院，河南 郑州 450046 2.河南省中药质量控制与评价工程技术研究中心，河南 郑州 450046 3.河南牧业经济学院动物医药学院，河南 郑州 450046

引 言

中药地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的新鲜或干燥块根[1]；始载于《神农本草经》，被列为上品，具有补血滋阴、清热生津、凉血止血、益精填髓等功效[2]。生地黄是将地黄新鲜或干燥块根缓缓烘焙至约八成干所得，生地黄性味甘、寒，归、心、肝、肾经，具有清热凉血，养阴生津等功效，用于温毒发斑、热入营血等症。地黄主要产于河南、山东、山西、河北等地，由“今人惟以怀庆地黄为上，亦各处随时兴废不同尔”等本草考证可知，河南作为地黄道地产区的地位没有动摇，故河南产地黄亦称为怀地黄，是我国著名的“四大怀药”之一，主产于河南温县、博爱、武陟、沁阳、孟州等地[3]。目前多运用HPLC技术对于地黄化学成分和质量进行定性和定量鉴别[4]，此方法需要复杂的样品前处理且周期较长，而傅里叶变换红外光谱法，避免了复杂的样品前处理，最大限度保留药材的原始信息，可以实现对药材的快速、无损检测[5]。

中药是复杂的混合物体系，其红外光谱图呈现出混合物体系中其各种成分的叠加谱，在同一峰位处，每种成分中只要具有相同的基团或者官能团，都会在此峰位处有一定的吸收[6]。因此，光谱图中的每个峰，都不仅代表一种物质，而是多种物质的叠合峰，此光谱图也就构成了图谱的宏观“指纹”性，同时也具有整体性特点，凭借其整体宏观“指纹”性特征，可直接或间接进行中药的鉴定鉴别与质量评价[7]。IR光谱具有整体性，客观性和科学性，可全面反映药材质量，化学计量学可以数字化的表达光谱信息，两者结合可更加客观地评价中药材的质量[9]。本研究采用红外光谱技术，建立不同产地生地黄的红外指纹图谱，结合正态分布分析、聚类分析(CA)和主成分分析(PCA)鉴别不同产地生地黄，为快速鉴别地黄、控制质量提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

傅里叶变换红外分光光度计为Spectrum 100 型(美国Pekin Elmer公司)；红外分析采用Spectrum for window3.02软件；粉末压片机为FW-4A型(天津市拓扑仪器有限公司)；FW-100型高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)；101-3AB型点热恒温鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；ME204E/OL型万分之一天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；溴化钾(光谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)；玛瑙研钵。

1.2 样品采集

43批地黄药材(编号：S1—S43)，经河南中医药大学药学院陈随清教授鉴定为玄参科植物地黄(R.glutinosaLibosch.)的干燥块根，30批河南产地黄药材(编号：S44—S73)，经河南中医药大学药学院陈随清教授鉴定为河南产怀地黄。取地黄药材样品洗净，于电热鼓风干燥箱中55 ℃烘干，样品粉碎，过200目筛，放入干燥器中备用。药材样品信息来源见表1。

表1 样品信息表

1.3 红外光谱采集

取样品2 mg与120 mg KBr置于玛瑙研钵研磨均匀，取适量混合均匀的样品置于专用压片模具中，以8 MPa压力压制30 s，压成均匀半透明的薄片，然后将薄片放置于红外灯下保持样品片干燥，采用红外光谱仪采集各样品红外光谱图。光谱范围4 000～450 cm-1，每张光谱扫描次数16次·s-1，光谱分辨率为4 cm-1，扫描速度0.2 cm·s-1，扫描时扣除CO2和H2O，室温20～25 ℃，相对湿度为25%～35%。

1.4 数据处理

将各样品红外原始光谱用Spectrum for window3.02软件进行处理，分别进行基线校正、归一化处理并计算红外光谱相对峰高，以不同产地地黄的相对峰高为原始数据使用SPSS19.0软件对不同产地地黄进行聚类分析及主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 不同产地地黄红外光谱分析

取不同产地地黄样品按照1.3节压制样品片并扫描其红外光谱。从不同产地生地黄红外光谱图可看出，其红外光谱指纹图谱峰形、峰位、峰高基本相似，不同产地地黄中含有相同的化学成分，所含的特征峰、形状基本一致，其中河南产地有个别特征峰的高度突出，指纹区存在一定差异，如图1所示。

图1 不同产地生地黄红外透过率叠加光谱

图2 各产地生地黄红外吸光度平均图谱

2.2 正态分布分析

运用Spectrum for window3.02软件将最初得到的红外光谱图由透过率T%转换成吸光度A，再依次进行基线校正，因生地黄中糖苷类成分最多，故选择1 200～900 cm-1波段范围内的最高峰归一处理，再分别计算特征峰相对峰高，如图3所示。得到一系列相关峰相对峰强值，经过对这些相对峰强度值去除离散值后，因河南为地黄的道地产区，对河南产的怀地黄(S44—S73)与其他省份(S1—S43)中各个省份地黄进行比较，利用正态分布曲线图进行辅助分析，如图4(a, b, c)所示，发现在1 639 cm-1处，河南产的怀地黄与其他省份的正态分布曲线交叉依次为：山东省>山西省>河北省，因此本方法能很好地将道地药材与非道地药材区分开。

图3 不同产地生地黄的相对峰高

图4 不同产地生地黄正态分布曲线图

2.3 聚类分析

运用Spectrum for window3.02软件将所采集的红外原始光谱由透过率T%转换成吸光度A，进行自动基线校正，自动平滑处理。选择1 200～900 cm-1波段范围内的最高峰的吸光度归一化处理，计算13个特征峰的峰强度。以73批不同产地地黄样品的13个特征峰的相对峰强度为原始数据，将数据输入SPSS19.0软件，采用组间连接法，以平方Euclidean距离为分类依据，横坐标为组间距离，纵坐标为样品编号，对样品进行系统聚类分析，结果见图5。当组间距离=10时，各省地黄基本上各自聚为一类，其中山东省生地黄(S38—S43)与山西生地黄(S9—S37)明显各自聚为一类；当组间距离=15时，不同产地生地黄药材可聚为2类，S1—S43聚为一类，S44—S73聚为一类即怀地黄聚为一类，山西、山东、河北等地的地黄药材聚为一类，说明河南产的怀地黄内部质量与山西、山东、河北的地黄药材存在一定差异。

图5 聚类分析树状图

2.4 主成分分析

主成分分析是从多个变量之间的联系入手，利用降维思想，将多个变量转化为少数几个互不相关、能反映原始变量信息变量的统计分析方法，在指纹图谱研究中具有简明、准确等优点。以73批地黄样品13个共有峰相对峰强度为原始数据，运用SPSS19.0软件标准化处理进行降维因子分析，主成分特征值及方差贡献率见表2，因前两个因子累计方差贡献率为87.101%>85%，充分代表了地黄样品13个共有峰的基本特征和主要信息，故选取其中特征值大于1的前2个主成分特征值分别为9.398和1.925因子作为主成分1、主成分2。由图6可见前2个因子斜率陡峭，后趋于平缓，可将前2个因子作为主成分。

图6 主因子碎石图

表2 主成分特征值及方差贡献率

主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向，将各特征向量中心化和标准化后，73批样品的主成分得分图(图7)，河南产地黄样品与主成分1均呈正相关，与主成分2大体呈正相关；山东产地地黄样品与主成分1呈负相关，与主成分2大体呈正相关；山西产地地黄样品与主成分1部分呈正相关，与主成分2均呈负相关；河北产地地黄样品与主成分1呈负相关，与主成分2呈正相关。综合得分计算是以主成分的贡献率为权数对主成分得分进行加权平均，即：主成分综合得分=(72.291×主成分1得分+14.810×主成分2得分)/87.101。对73批地黄样品主成分综合得分进行降序排列，综合得分越高表明药材质量越好[9]。如表3所示，主成分综合得分排序河南产地地黄主成分得分排名最为靠前，其次为山西运城地黄，排名最后的为山东产地地黄，表明地黄质量最好的为河南产区，山西产区次之，结合表3、图7可知对于地黄品质影响较大的为主成分1。

表3 主成分综合得分排序表

图7 不同产地地黄2个主成分的排序坐标图

3 结 论

傅里叶变换红外光谱分析避免了复杂的样品前处理过程，红外光谱作为分子结构分析方法之一，是官能团结构解析、未知物结构鉴定及其伪造掺假鉴别等的重要方法。红外光谱特征的信息整体性表征复杂混合物体系化学成分的复杂多样性。根据生地黄的化学成分特征来确定它的主成分特征峰和与其对应的特征波段, 确认具有的特征吸收峰(峰位置、峰形状以及相对峰高)。将地黄图谱进行基本处理后，对1 200～900 cm-1进行归一化处理，共标定13个共有峰，对其进行相对峰高的计算后，发现1 639 cm-1处河南产怀地黄峰高均值>0.45、1 424 cm-1处河南产怀地黄峰高均值≥0.55、1 354 cm-1处河南产怀地黄峰高均值>0.45和1 260 cm-1处河南产怀地黄峰高均值≥0.37，其他产地地黄这四个相对峰高均低于河南产怀地黄，可以此4个峰高为参考依据来区分怀地黄与其他地黄。

在不同产地中，河南产的怀地黄与其他省份地黄的图谱比较中，其光谱图均有“菩萨身”红外特征峰吸收。但因生长过程中不同的气候、温度、湿度、光照时间、土壤性质(例如酸碱性等、施肥、加工)等条件的影响，其质量就会存在较大的差异。1 900～1 750 cm-1(主要为酯类)、1 700～1 500 cm-1(主要为酸类)和1 200～950 cm-1(主要为糖类)范围内的振动吸收均有差别，主要就是在同一年限不同产地的条件下，由于各个地方气候、湿度、温度、土壤性质等等一系列条件的影响，进而导致各个产地地黄中所含大分子物质酯、酸、糖的相对含量各有不同，最后在红外吸收光谱图中表现出同一峰位处峰的相对强弱。红外指纹图谱结合正态分布、聚类分析和主成分分析为地黄的道地性检验提供了便捷的方法，也为地黄资源的综合开发提供参考。