耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌易感因素及其碳青霉烯酶表型分析

许晓波，杜恒超，陆尔杰

(1.浙江中医药大学 研究生院，浙江 杭州 310053；2.浙江省荣军医院 检验科，浙江 嘉兴 314001)

碳青霉烯类药物是一类具有β内酰胺环的抗生素。随着此类药物的应用，临床上对其产生耐药的革兰阴性杆菌也越来越多，这给临床治疗带来巨大的挑战[1]。从2005年到2017年，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对亚胺培南的耐药率从3.0%上升到20.9%[2]。分析耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(carbapenem-resistantEnterobacterales, CRE)感染的危险因素可以在一定程度上避免耐药菌的产生，为避免易感因素的暴露提供依据，同时也是预防医院感染的重要依据。碳青霉烯酶可分为A、B、C、D 4类，其中A、C和D类具有水解碳青霉烯类活性而被称为丝氨酸碳青霉烯酶。B类需要金属离子来催化活性，金属碳青霉烯酶就属于此类酶[3]。研究[4]显示，阿维巴坦有广泛抑菌作用，但仅对丝氨酸碳青霉烯酶有抑制作用。本文分析CRE产碳青霉烯酶情况，以期为临床应用阿维巴坦复合制剂药物提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集浙江省荣军医院2019年6月—2020年1月临床感染的耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌114株，其中包括大肠埃希菌14株、肺炎克雷伯菌86株、奇异变形杆菌5株、黏质沙雷菌8株、普罗维登斯菌1株，并选择同期同科室收集的碳青霉烯类药物敏感肠杆菌目细菌(carbapenem-sensitiveEnterobacterales，CSE)110株作为对照组(菌株分布与耐药组大致相同)。114株CRE采集的患者为CRE组，男79名，女35名；平均年龄(70.83±18.29)岁。110株CSE采集的患者为CSE组，男66名，女44名，平均年龄(73.77±17.23)岁。两组研究对象年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 数据收集 查阅相关文献及资料，结合患者病历病程，收集患者以下资料：患者年龄、性别，住院时间是否大于30天、ICU入住史、7天内是否进行机械通气，基础疾病情况(肺部疾病、高血压、糖尿病)，抗生素使用情况(碳青霉烯类、氨基糖苷类、β内酰胺类复合制剂、喹诺酮类)。

1.3 药敏试验 采用法国梅里埃VITEK-2 COMPACT 全自动微生物鉴定分析仪及配套 GN 鉴定卡、AST-GN13 药敏卡进行鉴定。根据CLSI M100(2019版)中的药敏判断标准，CRE为肠杆菌目细菌中对厄他培南最小抑菌浓度 MIC≥2 μg/mL、对亚胺培南或美罗培南 MIC≥4 μg/mL的菌株。所有耐药菌株均通过纸片法进行验证，亚胺培南及美罗培南抑菌圈直径≤19 mm(变形杆菌属、普罗威登菌、摩根氏菌除亚胺培南外的碳青霉烯类药物耐药确认为CRE)。质控菌株为大肠埃希菌 ATCC25922、肺炎克雷伯菌 ATCC700603及铜绿假单胞菌 ATCC27853，所有操作严格按照操作规程进行。

1.4 耐药表型分析

1.4.1 mCIM试验与eCIM试验 改良碳青霉烯类失活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)试验：取1 μL接种环菌于含2 mL TSB肉汤试管中，振荡混匀后加入1张含10 μg美罗培南的无菌纸片。乙二胺四乙酸碳青霉烯类失活法(ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM)试验：取1 μL接种环菌于含2 mL TSB肉汤试管中，振荡混匀后加入1张含10 μg美罗培南的无菌纸片，加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。两个实验的试管均放置于35 ℃孵育(240±15) min。用10 μL接种环取出美罗培南纸片，贴于已涂布大肠埃希菌ATCC25922悬液的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直径。mCIM试验抑菌圈直径6～15 mm，或抑菌圈直径16～18 mm但抑菌圈内有针尖样菌落，为mCIM试验阳性结果；抑菌圈直径≥19 mm为阴性结果；抑菌圈直径16～18 mm，或抑菌圈直径≥19 mm但抑菌圈内有散在菌落为中介结果。mCIM试验阳性结果表示菌株产碳青霉烯酶。当eCIM 试验与mCIM试验抑菌圈直径相差≥5 mm时为阳性结果，即菌株产金属碳青霉烯酶；当eCIM试验与mCIM试验抑菌圈直径相差≤4 mm时为阴性结果，即菌株产丝氨酸碳青霉烯酶，见封三图1A、图1B。

1.4.2 酶抑制剂增强试验 CRE菌株调0.5麦氏浊度，涂布于MH平板上，在平板四角距边10 mm分别贴上4张亚胺培南纸片，其中1张纸片加0.1 mol/L EDTA 10 μL，其中1张纸片加50 mg/mL 3-氨基苯硼酸6 μL，其中1张纸片同时加0.1 mol/L EDTA 10 μL和50 mg/mL 3-氨基苯硼酸6 μL，另1张纸片不加试剂。加EDTA/硼酸试剂纸片与不加试剂纸片抑菌圈直径相差>5 mm，表明分别产金属酶和丝氨酸酶。若加EDTA/硼酸试剂纸片与不加试剂纸片抑菌圈直径均>5 mm，表明既产金属酶又产丝氨酸酶，见封三图1C、图1D。

1.5 统计学分析 采用SPSS22.0软件，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 影响CRE感染的单因素分析 CRE组和CSE组患者住院时间大于30天、机械通气、患有糖尿病、联合使用抗生素、使用碳青霉烯类药物、使用氨基糖苷类药物、使用β内酰胺酶复合制剂、使用喹诺酮类药物、入住ICU比例比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 影响CRE感染的单因素分析[n(%)] Table 1 Univariate analysis of CRE infection [n(%)]

2.2 影响CRE感染的Logistic回归分析 以单因素分析结果为基础，P<0.05的因素为自变量，采用Logistic回归分析对CRE感染的影响因素进行分析。结果显示：住院时间大于30天、患有糖尿病、使用碳青霉烯类药物、入住ICU、使用β内酰胺酶复合制剂是CRE感染的危险因素(P<0.05)，联合使用抗生素是CRE感染的保护因素(P<0.05)，见表2。

表2 影响CRE感染的Logistic回归分析Table 2 Logistic regression analysis of CRE infection

2.3 耐药表型分析 mCIM试验与eCIM试验结果显示，114株CRE菌株中产丝氨酸碳青霉烯酶90株、产金属碳青霉烯酶24株。酶抑制剂增强实验结果显示，114株CRE菌株中产丝氨酸碳青霉烯酶90株、产金属碳青霉烯酶20株，既产丝氨酸碳青霉烯酶又产金属碳青霉烯酶4株。

3 讨论

文献[5]报道，CRE细菌可在肠道定植并在免疫力低下时发病。ICU患者免疫力低下且面临机械性操作，若医院感染防护措施不到位则容易导致耐药菌院内感染，危及患者生命。文献[6]显示，手术室、ICU、急诊科是CRE感染的重灾区。碳青霉烯类药物可在抗生素压力下导致细菌选择性产生耐药，易导致CRE菌株的产生。本研究检出CRE菌株114株，其中肺炎克雷伯菌86株(75.44%)，与秦慧玲等[7]研究结果一致。本研究结果显示，长时间住院、入住ICU、使用碳青霉烯类药物、糖尿病会导致患者更容易被CRE感染，这与杨璐等[8]分析的CRE感染的易感因素相符。

目前对CRE敏感的药物有多黏菌素、替加环素、磷霉素，但从总体上而言，治疗方案有限[9]。头孢他啶/阿维巴坦对A、C、D类酶有一定的效果，对B类酶无效，因此耐药表型检测对临床用药具有一定的指导作用[10]。研究[11]表明，mCIM联合eCIM试验、酶抑制剂增强试验在碳青霉烯酶表型鉴定中有较好的特异性和敏感性。mCIM联合eCIM试验的符合率为97.5%，酶抑制剂增强试验的符合率为96.3%[12]。CRE菌株的产酶情况结合病情，可以制定更为合理的用药方案。

综上所述，长时间住院、入住ICU、使用碳青霉烯类药物和β内酰胺酶复合制剂、糖尿病可导致患者更容易被CRE感染；开展耐药表型分析，可指导临床合理使用抗菌药物。