内分泌干扰物对卵巢功能的影响

尹小瑞 谢静燕 柳铮男 王莹东 张苏云

内分泌干扰物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)是一种会干扰激素作用的外源性化学物质或其混合物，如双酚A(Bisphenol A，BPA)、邻苯二甲酸酯、全氟辛酸、二恶英类以及工业化学品(如多氯联苯和多溴二乙醚等)。多数EDCs来源于产品生产过程、环境污染和农药，也有少部分存在于植物中。人类常通过呼吸道、消化道和皮肤黏膜接触到EDCs，其可能进入食物链并在动物组织中累积。EDCs的经典作用是模拟天然激素发挥激动或拮抗作用，从而影响神经、免疫和生殖功能，其甚至还能通过胎盘影响胎儿的发育和认知。目前相关研究已从分子生物学领域证明了几种EDCs会干扰靶细胞的细胞周期、凋亡途径和遗传调控。

卵巢是女性内分泌系统的重要组成部分，主要功能为产生卵子及分泌性激素。雌性生物出生时就存在数量有限的未成熟的始基卵泡，这是卵细胞储存的唯一形式。随着时间推移，机体中的一些卵泡会在性激素的调节下发育为初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡等，然后发生卵泡的募集及优势卵泡的选择，最后少量卵泡成熟发生排卵，约99%的卵泡发生闭锁，卵泡的闭锁涉及到促凋亡因子和抗凋亡因子的失衡等。性激素通过下丘脑和垂体中的反馈回路来调控月经周期，参与排卵、受精、着床及胚胎的发育等，其合成需要多种蛋白及酶类，如类固醇生成急性调节蛋白、细胞色素P450侧链裂解酶等。某些EDCs会通过影响一些关键酶的生成来影响卵泡发育和性激素的合成，从而影响卵巢的生殖和内分泌功能。某些EDCs会影响卵巢功能，导致生殖健康问题，如不孕、卵巢早衰和性激素水平异常,这些问题会降低患者生活质量，导致高额医疗费用，是亟待解决的公共健康问题;卵巢早衰还增加女性患骨质疏松症、抑郁症、心血管疾病等的风险。本篇综述回顾了特定EDCs[BPA、甲氧氯(Methoxychlor，MXC)、邻苯二甲酸酯和2,3,7,8四氯二苯并对二恶英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)]对卵巢卵泡发育和类固醇生成的影响及其作用于卵巢的可能机制。

1 BPA

BPA是双酚基丙烷，是由苯酚、丙酮在酸性介质中合成的，是环氧树脂、聚碳酸酯、酚醛树脂、不饱和聚酯树脂、阻燃剂等产品的重要原料，常用于制造聚碳酸酯塑料，如水瓶、运动设备、医疗和牙科器械等，含有BPA的环氧树脂也可用作制造聚氯乙烯水管壁、食品和饮料罐的涂层。因此，人类常通过消化道和皮肤接触BPA。目前，人类的血清、血浆、尿液、汗液、母乳、羊水、胎盘组织、胎儿血清和脐带中都测出含有BPA。BPA有一定的弱雌激素活性，与多种女性生育问题有关，如多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症，其可能通过影响子宫内膜的蜕膜化，从而引起不孕和一些妊娠并发症，也可诱导卵泡闭锁，降低原始卵泡池，并影响各种动物模型中类固醇激素的生成。

研究表明，BPA会抑制小鼠离体窦卵泡的生长。BPA导致卵泡生长抑制可能是通过影响类固醇激素的生成，干扰芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AhR)及调节细胞周期调节因子。Lee等进行的一项研究发现成年雌性大鼠接触BPA 90天，卵巢中类固醇合成急性调节蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein，Star)和细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450 aromatase，P450arom)蛋白下调，其可诱导半胱氨酸蛋白酶系统相关基因(如caspase-3)凋亡，从而促进卵泡闭锁和黄体退化。另外一项研究表明BPA主要通过增加抗凋亡因子与促凋亡因子表达水平的比率来抑制凋亡，从而破坏生殖细胞巢。此外，BPA还会影响卵母细胞的减数分裂和早期胚胎发育。

BPA还能影响卵巢性激素的水平。在大鼠卵巢卵泡膜细胞和颗粒细胞中，BPA不仅通过上调细胞色素P450类固醇生成酶如17α-羟化酶(17-αhydroxylase，Cyp17a1)、细胞色素P450侧链裂解酶(cholesterol side chain cleavage enzyme，Cyp11a1，P450scc)和Star的表达，显著增加睾酮和孕酮水平，还可下调类固醇生成酶Cyp19a1的表达来降低雌二醇水平。但Grasselli等发现，猪卵巢颗粒细胞暴露于BPA 48小时会降低孕酮(Progesterone，P)的产生，BPA浓度较低(0.1 μM)时可刺激雌二醇的产生，浓度较高(1 μM和10 μM)时则会抑制雌二醇的产生。此外，小鼠怀孕期间接触BPA会导致子鼠的死亡率增加，且使子鼠雌二醇水平升高，卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)的表达下降。BPA处理的大鼠雌二醇水平明显降低，血清FSH和黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)水平升高，这些研究提示BPA具有模拟雌激素作用及其相关反馈作用。还有研究表明，BPA可影响几种类固醇生成酶和其上游激素水平，进而破坏卵巢中正常类固醇激素的生成，BPA诱导的卵巢毒性可能和下丘脑-垂体-卵巢轴及氧化应激等有关，但还需进一步研究以证实。

2 MXC

MXC 属有机氯杀虫剂，其较滴滴涕(二氯二苯基三氯乙烷，简称DDT)毒性低且容易降解，广泛用于保护水果、蔬菜和庄稼。MXC是亲脂污染物，易在生物体的脂肪组织中累积，且在高水平食物链的动物组织中的生物积累浓度高于低水平的物种，因此，人类可通过消化道、呼吸道及皮肤接触MXC，其中主要是食物链途径。MXC主要被体内细胞色素P450酶代谢为1，1，1-三氯-2-(4-羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯基)乙烷和2,2-二羟苯基-1,1,1-三氯乙烷。

研究表明，MXC可破坏纺锤体组装和中心体蛋白定位，诱导DNA双链断裂，导致线粒体分布和功能异常，并降低卵母细胞体外成熟的能力。MXC及其主要代谢物可能下调G1-S期细胞周期调节剂[如细胞周期蛋白D2(Cyclin-D2，Ccnd2)和细胞周期蛋白依赖性激酶4(Cyclin-dependent-kinases4，Cdk4)]的表达，降低抗凋亡因子(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和增加促凋亡因子(BCL2-Associated X，Bax)的表达，从而抑制离体窦卵泡的生长。Tannenbaum等连续20天每天给小鼠腹腔注射MXC(64 mg/kg)，于给药结束后30天及60天各处死一半小鼠，结果表明，给药结束后30天，MXC明显增加了卵泡闭锁，减少了原始卵泡和总卵泡数量，但不影响小鼠生育能力。但在给药结束后60天，MXC对小鼠生育能力、卵泡数量或闭锁无显著影响。总的来说，这些数据表明卵巢功能可能在MXC处理20天后受到影响，但后期可能会恢复。

Roepke等认为MXC可能通过胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1，Igf1)和5-羟色胺受体(5 Hydroxytryptamine receptor，5HtR)来影响女性生殖功能。MXC及其代谢产物可通过下调类固醇生成酶Cyp19a1和上调雌激素代谢酶(Cytochrome P450 1b1，CYP1b1)来降低雌激素水平。MXC及其代谢产物可直接抑制胎盘3β-羟基类固醇脱氢酶-1(3 beta and steroid delta-isomerase 1，HSD3β1)，从而阻止孕激素的产生。此外，还有研究发现MXC对卵巢的损伤与时间有关，MXC不仅干扰激素代谢，而且改变参与抗氧化应激和解毒过程的代谢酶。

3 邻苯二甲酸酯

邻苯二甲酸酯是在环境中普遍存在的合成化学物质，已知其具有扰乱内分泌的特性。邻苯二甲酸酯存在于空气中，特别是室内空气，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[Bis(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]是聚氯乙烯材料最常用的增塑剂，可用于医疗器械和医疗手套等，因此，人类常通过呼吸道和皮肤接触到邻苯二甲酸酯。日常消费品中也广泛存在邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)、邻苯二甲酸丁基苄酯(Butyl benzyl phthalate，BBP)和邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate，DEP)。

研究表明,邻苯二甲酸酯能影响卵泡生长发育，损害卵泡功能。邻苯二甲酸酯混合物会导致细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 2a，Cdkn2a)表达增加，Ccnd2表达减少，使减数分裂同源重组缺陷，导致细胞停滞在G1期，从而抑制了窦卵泡的生长。Shin等发现接触邻苯二甲酸酯会导致胚胎死亡率升高及卵母细胞染色体异常。此外，邻苯二甲酸酯也会对卵泡的健康产生不利影响。研究发现，邻苯二甲酸酯组减少了初级和次级卵泡数量，增加了闭锁卵泡数量，同时给药组显著增加了Tunnel凋亡阳性的细胞数量和Bax/Bcl-2的表达水平，这些都提示了卵巢细胞的凋亡。

研究发现女性尿液中大多数邻苯二甲酸酯代谢物的个体浓度及其总和与雌二醇浓度呈负相关，但与FSH浓度呈正相关。体内外研究均表明，大鼠接触邻苯二甲酸酯会降低血清雌二醇水平。这些效应可能是由于邻苯二甲酸酯抑制了性激素合成相关酶(如Cyp17a1、Cyp19a1)的表达。还有研究发现邻苯二甲酸酯可导致循环雌激素减少，血清FSH水平增加，并改变了涉及凋亡和类固醇生成的相关基因表达，这些影响与小鼠接受的邻苯二甲酸酯剂量有关。总的来说，邻苯二甲酸盐混合物可影响卵泡的生长，降低类固醇激素的生成。

4 TCDD

TCDD是一种持久性环境污染物，是一种毒性较大的二恶英类化学品，是制造除草剂和杀虫剂的副产品，另外，森林火灾、城市废物焚烧和纸浆漂白等过程也会产生大量TCDD。它的环境半衰期较长，会在人体脂肪组织、血清、母乳和卵巢卵泡液中累积。

研究一致表明，TCDD影响卵泡的发生，从而影响卵巢功能。Karman 等发现在小鼠中，TCDD不影响体外窦卵泡的生长，表明它不影响颗粒细胞的增殖。但在大鼠中，TCDD减少窦卵泡的数量，而闭锁不增加，这表明TCDD抑制大鼠卵巢卵泡的增殖。TCDD通过芳烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AhR)途径发挥作用。Piasecka-Srader 等发现TCDD培养颗粒细胞1 h和48 h后降低了芳烃受体蛋白水平的表达，而转录水平仅在48 h后受到影响。但在敲除芳烃受体的猪颗粒细胞中，TCDD影响了多个基因的表达，包括影响卵泡发育和卵母细胞成熟[如趋化因子受体(C-X-C-motif chemokine receptor 4，CXCR4)]、增殖和分化[如细胞分裂周期(cell division cycle 45，CDC45)]的基因，这说明TCDD也可以不依赖AhR途径影响基因表达。TCDD还可能通过影响颗粒细胞周期、增殖和DNA修复、重排细胞骨架和细胞外基质以及调节细胞对应激反应的重要蛋白而影响卵巢的卵泡发育。

除了干扰卵泡生长和排卵外，TCDD还能干扰卵巢类固醇激素的生成。国外研究表明，在分离的小鼠窦状卵泡中，TCDD暴露(0.1～100 nm)以非单调剂量反应方式降低孕酮、雄烯二酮、睾酮和雌二醇水平。孕烯醇酮底物(10 μM)的添加使激素水平恢复，这表明TCDD可能在孕烯醇酮形成之前起作用。TCDD通过抑制关键类固醇生成酶[如17β羟基类固醇脱氢酶(Estradiol 17-beta-dehydrogenase 1，Hsd17β1)]来抑制卵巢类固醇激素的生成。此外，TCDD以时间依赖性而非剂量依赖性方式降低人黄体化颗粒细胞产生雌二醇。有研究证明TCDD具有跨代卵巢毒性，母体暴露于TCDD不仅会显著降低子代雌二醇水平，还会导致原始卵泡减少，次级卵泡和黄体数量增加，这可能与印迹基因胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,Igf2)的表达下调有关。

以上研究表明，像激素和其他环境污染物一样，TCDD作为EDCs，可能与氧化应激、雌激素/抗雌激素作用、类固醇代谢的调节有关，在卵巢中可能有多种作用模式。

EDCs在人们的生活生产环境中无处不在，引起卵巢功能不全、不孕等生殖方面和心血管、骨骼等其他非生殖方面的问题。EDCs已成为威胁人类生殖健康的重要因素，但其具体作用机制仍不清楚，未来可从整体上研究其对下丘脑-垂体-性腺轴的影响。此外，人类常接触多种EDCs混合物，其生殖毒性可能存在协同作用，因此应进一步研究其混合物对卵巢的影响，并增加流行病学调查。通过相关的调查研究，卫生组织及政府应意识到环境EDCs的毒性作用，严控环境污染，从源头上控制其不利影响，如督促企业在生产制造过程中用安全的替代品替代EDCs或投入资金资源来研究清除环境EDCs的方法。同时，还需要进一步了解EDCs对成人卵巢的影响及其机制，从而在未来制定更好的方案来防治EDCs诱发的卵巢毒性。