倒心盾翅藤总皂苷提取工艺优化

王婉丽 樊馨 陈雄敏 李婷婷 杨亚彬 李宜航 李光

【摘 要】 甾体总皂苷为倒心盾翅藤抗肾结石的活性成分，该研究选用菝葜皂苷元为对照品，以1%茴香醛-硫酸作为显色剂，建立倒心盾翅藤甾体总皂苷含量测定方法。分别评价了乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间对甾体总皂苷得率的影响，并且进一步通过响应曲面法优选提取工艺为乙醇体积分数50%、液料比15、提取温度100 ℃、提取时间3 h，甾体总皂苷得率为2.37%±0.19%。该提取工艺稳定可行，所得甾体总皂苷生物活性明确。

【关键词】

倒心盾翅藤;甾体总皂苷;比色法;响应面设计

【中图分类号】R284.2   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2021）19-0027-05

Optimization of Extraction Technology for Total Saponins in Aspidopterys Obcordata Vines

WANG Wanli1 FAN Xin1 CHEN Xiongmin2 LI Tingting3 YANG Yabin3 LI Yihang4 LI Guang4*

1.Xishuangbanna Vocational and Technical College， Jinghong 666100，China;

2.West Yunnan Universtity of Applied Sciences， Jinghong 666100，China;

3. Peoples hospital of Xishuangbanna Dai autonomous prefecture，Jinghong 666100，China;

4. Yunnan Branch， Institute of Medicinal Plant， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Jinghong 666100，China

Abstract：

The extracting technology of Total Saponins from Aspidopterys obcordata vines was optimized. Sasaponin was selected as a reference， and 1% anisaldehyde-sulfuric acid was used as a coloring agent to establish a quantitative method for the determination of total saponins of Aspidopterys obcordata vines. The effects of ethanol volume fraction， liquid-to-material ratio， extraction temperature， and extraction time on the yield of total steroidal saponins were respectively evaluated， and the extraction process was further optimized by response surface method as ethanol volume fraction of 50%， liquid-to-material ratio of 15 and extraction temperature of 100 ℃， extraction time 3h， the yield of total steroidal saponin was 2.37%±0.19%. This extraction method can obtain total saponins with clear biological activity， accounting for 2.3% of the quality of medicinal materials， which is stable and feasible.

Key words：

Aspidopterys obcordata vines; Total Steroidal Saponins; Colorimetric Method; Response Surface Design

傣药倒心盾翅藤为Aspidopterys obcordata HemsL.金虎尾科植物倒心盾翅藤的木質藤茎，傣药名嘿盖贯，主要分布于越南、缅甸北部、泰国以及我国的海南、云南等地，生长在山地雨林、沟谷雨林及季雨林的林缘、疏林及灌木丛中[1-2]。该药性涩、凉，有消炎利尿、清热排石之功效，傣族民间常用于泌尿系炎症、感染及结石的治疗，也用于产后消瘦，恶露不尽等症，是傣医传统经方“五淋化石胶囊”的主要组方药材，同时也是目前傣医临床用量最大的一味药材[1， 3]。倒心盾翅藤中含有多种类型的化学成分，包括鞣质、甾体、酚酸、蒽醌、三萜以及黄酮类化合物，经实验证实具有抗炎、抗肿瘤、抗结石等多种药理活性[4-5]。在抗结石活性的研究中，倒心盾翅藤中甾体总皂苷被逐步证实是其抗结石的主要活性成分之一[6-7]。为了更好的满足防治肾结石的需求，也是为了充分开发利用倒心盾翅藤植物资源，本研究对倒心盾翅藤甾体总皂苷的提取方法进行了优化，并对提取物活性进行了验证。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器 分析天平（美国奥豪斯，DV215CD）;小型台式组织脱水机（赛默飞世尔科技，STP 120）;组织包埋机（赛默飞世尔科技，HISTOSTAR）;全自动切片机（赛默飞世尔科技，HM355S）;染色机（赛默飞世尔科技，GEMINI AS）;电热鼓风干燥箱（中兴，101型）;光学显微镜（OLYMPUS，BX53）;离心机（SIGMA，3K15）;电热恒温水浴锅（北京永光明医疗器械有限公司，DZKW-S-6）;旋转蒸发仪（BUCHI Labortechnik AG，R-210）;超声清洗机（宁波科技园区新江南仪器有限公司，JN-500DT）;真空泵（莱伯泰科，VP50）。

1.2 实验药材与试剂 倒心盾翅藤药材饮片购于西双版纳傣族自治州傣医医院，保存于样品室，提取前粉碎过筛。菝葜皂苷元（中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-18081402，纯度：99.57%）;茴香醛（阿达玛斯，批号：P1438355，质量分数：99%以上）;无水乙醇（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）;甲醇（分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司）;硫酸（分析纯，重庆川东化工有限公司）;水为自制纯水。

2 方法与结果

2.1 甾体总皂苷的测定方法

2.1.1 工作溶液的配制 样品溶液：倒心盾翅藤粉末加乙醇回流提取，浓缩、干燥，即得样品。精密称取样品适量，加甲醇，配制成1 mg·mL-1的供试品溶液。对照品溶液：精密称取菝葜皂苷元对照品加甲醇溶解定容，配制成0.2 mg·mL-1的对照品溶液。显色剂：取8 mL甲醇至10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL浓硫酸，冷却至室温， 加100 μL茴香醛， 摇匀，即得1%茴香醛-硫酸显色剂[8-9]。

2.1.2 线性关系考察 取1 mL对照品溶液挥干，加入4 mL显色剂，置100 ℃水浴中保温20 min，冰水浴10 min，补加显色剂至10 mL，以甲醇做空白对照于380～800 nm波长进行扫描[8-10]。菝葜皂苷元在428.5 nm处有最大吸收峰，选择 428.5 nm作为测定波长。

分别精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL挥干，显色后于428.5 nm处测定吸光度。以吸光度为横坐标，甾体总皂苷浓度为纵坐标，计算得到回归方程为：y=0.3686x - 0.012，R2=0.9966，线性范围0.04088～0.4088。

2.2 单因素试验考察及结果

2.2.1 考察乙醇体积分数对总皂苷得率的影响 选择液料比为11.5、提取温度为75 ℃、提取时间为1.5 h，乙醇体积分数分别为35%、50%、65%、80%、95%、100%，加热提取后浓缩回收乙醇，测定皂苷含量，计算得率。乙醇体积分数为50%时，总皂苷得率最高，为2.15%。当乙醇体积分数超过50%以后，总皂苷得率开始下降，故选择乙醇体积分数为50%最佳，见图1。

2.2.2 考察液料比对总皂苷得率的影响 在乙醇体积分数为65%、75 ℃、提取1.5 h条件下，液料比分别为4.5、8、11.5、15、18.5、22进行提取，比较总皂苷得率。随着液料比增大，总皂苷得率总体呈上升趋势，液料比达到22时，总皂苷得率2.44%。考虑到实际生产中成本的投入与产率，故选择液料选择15最佳，见图2。

2.2.3 考察提取温度对总皂苷得率的影响 使用65%乙醇、液料比为11.5，分别在75 ℃、85 ℃、95 ℃、100 ℃下回流提取1.5 h，比较总皂苷得率。随着提取温度的升高，总皂苷得率呈上升趋势。100 ℃时，总皂苷得率达到最高，为2.21%，见图3。

2.2.4 考察提取时间对总皂苷得率的影响 选择65%乙醇、液料比为11.5、75 ℃分别提取1、2、3 h，计算总皂苷得率如图4所示。随着提取时间增加，总皂苷得率不断增加，达到3 h时总皂苷得率为1.77%。在實际生产中考虑到成本的生产效率，故提取时间选择3 h。如图4所示。

2.3 Box-Behnken设计-响应面法优选提取工艺及结果 在单因素实验的基础上进行4因素3水平设计，采用Design Expert 10软件设计响应面实验。选取甾体总皂苷得率作为响应值，乙醇体积分数（A）、液料比（B）、提取温度（C）、提取时间（D）自变量进行实验设计。响应面试验设计及结果见表1。

对表1和表2中的试验结果进行拟合分析，得到倒心盾翅藤中甾体总皂苷提取工艺参数回归方程为： Y=1.43-0.50A+0.079B+0.21C+0.034D+0.37AB-0.21AC+0.018AD+0.37BC+0.095BD+0.084CD。回归模型的P值=0.0008（P<0.01），差异显著，且失拟项P值=0.7412（P>0.05），差异不显著，决定系数R2=0.7575，表明无失拟因素存在，方程与试验拟合度较好，可用于倒心盾翅藤中总甾体总皂苷提取。见表2。

回归方程各项方差分析表明4个影响因素对倒心盾翅藤中甾体总皂苷含量影响的大小顺序依次为：乙醇体积分数>提取温度>液料比>提取时间，方程一次项（A、C）和交互项（AB、BC）影响都是显著的（P<0.05），方程一次项（B、D）和交互项（AC、AD、BD、CD）影响不显著（P>0.05）。

各因素两两交互作用对总皂苷含量的影响的3D响应曲面图如图5所示，乙醇体积分数和液料比、乙醇体积分数和提取温度、液料比和提取温度响应曲面图等高线呈椭圆形，表明两因素之间交互作用显著;而提取温度和提取时间、液料比和提取时间、乙醇体积分数和提取时间两因素之间的交互作用不显著。该结果与回归方程方差分析结果一致。

根据回归模型最优组合分析，最优提取工艺参数为： 乙醇体积分数50.28%、液料比15、提取温度99.99℃、提取时间3h，其倒心盾翅藤中甾体总皂苷得率预测值为2.43%。根据实际情况调整最优提取工艺参数为：乙醇体积分数50%、液料比15、提取温度100 ℃、提取时间3 h进行倒心盾翅藤中甾体总皂苷提取验证试验，3次平行试验实际测得的甾体总皂苷平均得率为2.37%±0.19%，与模型理论预测值之间的相对误差为1.65%，表明所得结果准确可靠。

2.4 倒心盾翅藤总皂苷生物活性验 人肾小管上皮细胞HK-2复苏后，完全MEM培养基培养于37 ℃，5% CO2浓度的培养箱内，每3天换液一次。细胞生长至85%以上密度时胰酶消化传代，接种到96孔板中，每孔4000个细胞，培养24 h。吸出培养基，加入含有一水草酸钙结晶和倒心盾翅藤总皂苷的无血清MEM培养基100 μL，每孔一水草酸钙含量为28 μg·cm-2，给药组倒心盾翅藤总皂苷含量分别为1.56，3.12，6.25，12.5，25.0μg·mL-1，每个剂量设置3个复孔。空白对照孔加入等体积无血清MEM培养基，培养24 h后，小心移除培养基，每孔加入CCK-8试剂10 μL，继续孵育4 h后，酶标仪中450 nm处测定OD值。计算细胞相对存活率：各组OD值/空白组OD值×100%。结果采用均数加减标准差的方式表示，各组间的比较采用单因素方差分析法，以P<0.05作为差异具有统计学意义。实验结果证明，倒心盾翅藤总皂苷在1.56～25.0μg·mL-1范围内可以明显减轻由草酸钙结晶引起的HK-2细胞的损伤，与模型组比较，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。这表明，上述工艺获得的总皂苷可通过减少肾小管上皮细胞损伤抑制结石成分的黏附，具有防治肾结石的生物活性。

3 讨论

皂苷是糖的衍生物，非糖的部分称为苷元。甾体皂苷的苷元部分是螺甾烷的衍生物，主要分布薯蓣科、百合科等植物中，具有抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗炎、抗血栓、增强免疫、抗菌等多种功效[11]。倒心盾翅藤中的甾体皂苷成分也是其治疗肾结石有效成分之一。甾体皂苷的检测方法通常有分光光度法和高效液相法。为了优化提取工艺，本研究首先建立了倒心盾翅藤甾体皂苷成分的检测方法。因倒心盾翅藤甾体皂苷成分在液相色谱仪的紫外检测器和蒸发光散射检测器中均无吸收峰，因此采用了分光光度法。分别测试了浓硫酸-甲醇、茴香醛-硫酸、香草醛冰乙酸三种显色试剂，确定经过1%茴香醛-硫酸显色结果较好[9， 12-13]。显色后，菝葜皂苷元和受试样品在428.5 nm处有吸收，据此建立了较为可靠的倒心盾翅藤甾体皂苷比色定量方法。

甾体皂苷提取工艺包括冷浸提取、加热提取、超声辅助提取、微波辅助提取、酶法辅助提取等多种形式。本研究中应用的是加热提取法，符合工厂生产的常规工艺，并优选了乙醇和水作为提取溶剂，避免了有机试剂的残留。根据单因素实验优选倒心盾翅藤甾体皂苷的提取方法，作为响应曲面试验的因素水平，通过 Box- Behnken 响应曲面法考察乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间对皂苷得率的影响，确定了最佳的提取工艺为乙醇体积分数50%、液料比15、提取温度100 ℃、提取时间3 h，该条件下甾体总皂苷得率为2.37%±0.19%，与模型预测值相符。所获得的皂苷经过体外细胞实验验证，具有抗肾结石的生物活性。本研究提出的倒心盾翅藤甾体皂苷提取工艺稳定可行，所获得产物药理活性较为明确，为倒心盾翅藤的开发应用提供了参考。

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（收稿日期：2021-02-05 编辑：刘斌）