藏药红景天苷对斑马鱼发育及急性毒性的评价

樊红艳 何树梅 杨建伟 刘红旭

【摘 要】 目的：评价藏药红景天苷（Salidroside，SAL）对斑马鱼胚胎发育及幼鱼的急性毒性作用，为红景天苷在斑马鱼模型中的研究空白提供理论依据，同时也为后期实验进展奠定基础。方法：在显微镜下挑选6 h（6 hour-post-fertilization，6hpf）及受精后4d（4 days-post-fertilization，4dpf）的斑马鱼胚胎和幼鱼，分别暴露在0.8、1.6、3.2、6.4、12.8不同浓度梯度的红景天苷溶液及空白对照（养殖水）中，观察暴露12、24、48、72 h胚胎發育及幼鱼的畸形及死亡情况。结果：斑马鱼胚胎及幼鱼暴露于红景天苷不同浓度组（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）均无明显的致畸、致死作用。结论：藏药红景天苷在受试剂量下对斑马鱼胚胎及幼鱼无明显的急性毒性及致畸作用。

【关键词】

红景天苷;斑马鱼;致畸作用;急性毒性

【中图分类号】R994.39   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2021）19-0018-04

Evaluation on the Development and Acute Toxicity of Rhodioside to Zebrafish

FAN Hongyan HE Shumei* YANG Jianwei LIU Hongxu

Key Laboratory of Life Sciences University of Xizang Nationalities University Medical Department，Xianyang 712082， China

Abstract：

Objective To evaluate the acute toxicity of Salidroside（SAL） in zebrafish embryos and larvae.Methods Normally developed 6hpf（6 hour-post-fertilisation， 6hpf）zebrafish embryos and 4dpf （4 days-post-fertilisation 4dpf） larvae selected under microscop，then exposed to 5 different concentrations of Salidroside solutions，control group（cultivation water） respectively.The teratogenicity rate of embryo，mortality rate of enmryos and larvae，were calculated on 12， 24， 48， and 72 h respectively.Results Salidroside does not show significant teratogenic and lethal effect in zebrafish embryos and larvae are exposed at the does levels of 0.8，1.6，3.2，6.4，12.8 mM.Conclusion Salidroside has no acute toxicity and teratogenic effect on zebrafish embryo and larvae under the experimental dose.

Key words：

Salidroside; Zebrafish; Teratogenic Effect; Acute Toxicity

藏药是民族医药的代表之一，在我国传统医药中发挥着重要作用。藏药红景天是景天科多年生草本植物，又名“扫罗玛布尔（藏语）”“蔷薇红景天”等，被人们称为“高原人参”[1]。红景天苷（Salidroside，SAL）是由红景天中提取的一种主要有效成分[1]。近年来，红景天苷在是一种开发前景较好的药物，在临床上得到日益广泛的应用。在抗衰老方面，红景天苷通过激活AMPK磷酸化，抑制NF-κBp65和NLRP3炎性小体的活化来改善内皮炎症和氧化应激反应[2]。据报道[3]：红景天苷中分离出的一种成分与白藜芦醇具有相当的抗衰老效果，通过miR22/SIRT1途径增加线粒体的生物合成，从而延缓衰达到抗衰老的功效。在抗肿瘤方面，红景天苷一方面通过抑制相关信号通路的激活降低肿瘤细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的生长，诱导其发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长和转移[4-6];另一方面通过增强巨噬细胞的吞噬功能和T、B淋巴细胞的免疫功能来预防肿瘤的发生和发展[7]。在抗炎症方面，红景天苷在各种病理状态下均具有抗炎活性，较其他抗炎制剂安全性更高、副作用更小[8]。其他方面，红景天苷还能够促进大鼠脊髓损伤的功能恢复[9]，通过AKT /GSK3β信号传导抑制血小板功能和血栓形成，在治疗血栓或心血管疾病方面具有重要的作用[10]等。红景天苷对不同疾病的治疗及预后起到了积极的保护作用，因而具有重要的研究价值。

新兴的模式生物斑马鱼以其胚胎透明、发育迅速、体积小、成本较低等优势已被广泛应用于发育生物学和人类疾病的研究中[11]。斑马鱼的胚胎具有药物渗透性，可应用于药物研究及毒性的研究[12]，为评价药物毒性提供了理想的工具。本研究采用受精后6h（6 hours-post-fertilization，6hpf）斑马鱼胚胎及受精后4d（4 days-post-fertilization，4dpf）幼鱼来评价红景天苷急性毒性效应及对斑马鱼胚胎发育的致畸作用，为确定红景天苷对斑马鱼疾病模型的安全剂量提供依据。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 野生型AB斑马鱼由上海市公共卫生临床中心斑马鱼实验室饲养提供。循环养殖水根据实验室斑马鱼使用指南[13-14]中的方法配置。水温控制在（28±0.5）℃，PH值7.0～7.2，电导率450～550 μS/cm，光亮/黑暗周期为14 h/10 h。成年斑马鱼每日喂食3次（人工孵育丰年虾2次，辅助饲料1次）。

1.1.2 实验试剂 红景天苷购置于上海诗丹德标准技术服务有限公司。

1.1.3 实验仪器 斑马鱼饲养系统（上海鳞道）;变倍体视显微镜（日本奥林巴斯）;生化培养箱（济南创日新）;六孔板;移液枪;塑料吸管;50ml离心管;培养皿;交配缸。

1.2 实验方法

1.2.1 斑马鱼的配种及胚胎的收集 实验前一晚8点将野生型雌雄斑马鱼按照1∶1或1∶2配对，放入装有隔板的交配缸中，第二天早上8点给予光照，抽离隔板，雄鱼开始追逐雌鱼并在30 min内完成交配产卵。产卵完成后，用养殖水轻柔冲洗数次除去未受精卵、粪便等残留物后收集于盛有养殖水的培养皿中，置于28.5 ℃温箱中培养待用。

1.2.2 给药方法 给药方式为浸泡法，具体实验方法参照文献[15]所述以及Patricia McGrath的斑马鱼评价药物安全和毒性方法[16-17]进行。

1.2.3 红景天苷样品溶液的配置 本实验使用胚胎培养液将母液稀释至0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM五个浓度梯度。

1.2.4红景天苷对斑马鱼胚胎致畸试验方法 在显微镜下挑选受精后6 h（6 hour-post-fertilization，6hpf）且发育状态良好的胚胎，并将其随机转入含有不同浓度红景天苷溶液的6孔板，每板设置5个（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）药物浓度，同时以养殖水作为空白组，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃温箱中培养，每隔24 h更换红景天苷样品溶液1次，以保证溶液中各参数稳定，分别于给药后12、24、48、72 h观察并记录胚胎的形态学变化。其中，畸形的种类主要有卵黄囊肿大、尾部弯曲、鱼鳍缺失、心包肿胀。取不同亲本的胚胎重复三次试验。

1.2.5 红景天苷对斑马鱼胚胎毒性试验方法 在显微镜下挑选受精后6 h（6 hour-post-fertilization，6hpf）且发育正常的胚胎，并将其随机转入含有不同浓度红景天苷溶液的6孔板，每板设置5个（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）药物浓度，同时以养殖水作为空白组，每孔40枚胚胎。置于28.5 ℃温箱中培养，每隔24 h更换红景天苷样品溶液1次，以保证溶液中各参数稳定，分别于给药后12、24、48、72h观察并记录胚胎的死亡变化。取不同亲本的胚胎重复三次试验。

1.2.6 红景天苷对斑马鱼幼鱼毒性实验方法 在显微镜下挑选受精后4 d（4 days-post-fertilization，4dpf）且发育正常的胚胎，并将其随机转入含有不同浓度红景天苷溶液（0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM）的培养皿，同时以养殖水作为空白组，每皿20尾于28.5 ℃恒温生化培养箱中培养，每隔24 h更换红景天苷样品溶液1次，以保证溶液中各参数稳定，分别于给药后24、48、72 h观察并统计幼鱼的死亡率。取不同亲本的幼鱼重复三次试验。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0软件对数据进行统计处理，采用统t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 红景天苷对斑马鱼胚胎发育的评价 在显微镜下观察斑马鱼胚胎在不同时间点时不同浓度的红景天苷溶液中与空白对照组相比，畸形数均≤2，均没有出现心包水肿、脊柱弯曲、尾部弯曲及溶解畸形等现象。空白对照组与不同浓度的红景天苷组畸形率比较，无统计学差异（P>0.05），表明在受试剂量下，红景天苷对斑马鱼胚胎的发育无明显的致畸作用（图1）。

2.2 红景天苷对斑马鱼胚胎急性毒性的评价 在显微镜下分别观察12、24、48、72 h斑马鱼胚胎在不同时间点各组的死亡数，不同浓度的红景天苷组与空白对照组相比，死亡数均≤2，无统计学差异（P>0.05），表明在受试剂量下，红景天苷对斑马鱼胚胎相对安全，无明显的急性毒性作用。如图2所示。

2.3 红景天苷对斑马鱼幼鱼急性毒性的评价 将4dpf（4 days-post-fer fertilization，4dpf）的斑马鱼幼鱼分别暴露在不同浓度的红景天苷溶液中，分别在给药后24、48、72 h观察幼鱼的死亡情况。与空白对照组相比，不同浓度的红景天苷组幼鱼的死亡数均≤2，无统计学差异（P>0.05），不同浓度的红景天苷对斑马鱼幼鱼无明显的急性毒性作用。如图3所示。

3 讨论

本研究以理想的模式生物斑马鱼为模型，采用浸泡给药的方式来评价红景天苷对于斑马鱼胚胎的发育及幼鱼的急性毒性作用。结果表明，在浓度为0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 mM的红景天苷溶液对斑马鱼胚胎发育无致畸作用，对其胚胎和幼鱼无明显的急性毒性作用，这一结果与大鼠模型中的结果相似[18]，是否更高的剂量浓度能够对斑马鱼胚胎的发育及幼鱼产生致畸作用及毒性作用暂不明确。

红景天苷作为一种重要的藏药，具有较高的药用价值，而利用斑马鱼模型来评价红景天苷的毒性试验尚未报道。希望可以通过斑马鱼模型来完善对红景天苷毒性的认知，以期为红景天苷在斑马鱼疾病模型的安全用量提供理论依据，同时也能够为我们后续实验进展奠定基础。

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（收稿日期：2021-02-23 编辑：刘斌）