盐酸小檗碱联合喹诺酮对产超广谱β内酰胺酶肺炎克雷伯菌的体外抑菌作用的研究

周晓元 罗润齐 王俊洁 张宿荣 许晓明 杨 洋 叶晓光

广州医科大学附属第二医院 广东广州 510260

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KPn)，属于兼性厌氧革兰阴性菌，是肠杆菌科克雷伯菌属中重要的菌属之一,检出率高，是医院感染的重要致病菌之一[1-3]。其中产超广谱β内酰胺酶(extended spectrum β-Lactamases，ESBLs)是主要的耐药机制之一，产ESBLs是由质粒介导的，能催化水解β-内酰胺环酰胺键灭活酶，对β-内酰胺类抗生素包括霉素类、头孢菌素类(1-4代)、氨曲南等单环酰胺类药物均耐药[4-5]，但随着临床上越来越多的革兰阴性菌形成产ESBLs耐药菌株，产ESBLs KPn对环丙沙星的耐药率高达30%以上[6]，耐药情况越发严重。寻找一种耐药率低、副作用小的抑菌药物单用或联用喹诺酮类抗生素(Quinolones，FQNS)，改善产ESBLs KPn对喹诺酮类药物的耐药性，是迫在眉睫的任务。

盐酸小檗碱(Berberine，Ber)，是国内外研究都被视为一种抗菌药物[7-9]，有研究报道[10-13]，Ber具有抑制耐药金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的生长及逆转耐药性，但 Ber联用FQNS对产ESBLs KPn的治疗研究相对较少，本研究测定Ber联用3种FQNS：环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、左氧氟沙星(levofloxacin，LVX)及加替沙星(Gatifloxacin，GAT)的体外抑菌作用，探讨Ber能否增加FQNS的抗菌活性、增强抑菌作用并测定外排泵系统acrA、acrB和tolC表达量情况，查看是否通过改变表达量而达到更好的抑菌效果，为临床上产ESBLs KPn的治疗提供新并有效合理的解决方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 收集2019～2020年，广州医科大学附属第二医院检验科细菌室血液、痰液、尿液等分离的临床KPn标本。经过VITEK—AM60型全自动细菌鉴定与药敏分析系统(法国bioMérieux)鉴定，剔除重复菌株，根据CLSI标准，筛选出产ESBLs KPn 20株，分别命名为KPn1、KPn2、KPn3……KPn 20,ATCC700603肺炎克雷伯菌作为质控菌，来源于广东省临床检验中心。

1.1.2 主要仪器 全自动细菌鉴定与药敏分析系统(VITEK—AM60型)，HS-1300-U洁净工作台，细菌比浊仪，KS260水平摇床，Ultrospec 2100 pro紫外分光光度计，iCycler 582BR型PCR 扩增仪，RT-PCR系统(7500型)。

1.1.3 培养基及主要试验试剂 Ber标准品(上海原叶生物有限公司(≥98%纯度))，CIP标准品、LVX标准品、GAT标准品(上海信然实业有限公司(≥99%纯度))，MH琼脂培养基、Yeast extract、Tryptone(英国OXOID公司)，溶菌酶(Sigma公司)、RNeasy Protect Bacteria Mini Kit(QIAGEN公司)，PrimeScript RT reagent Kit(Takara公司)，SYBR Select Master Mix reagent(Applied Biosystems公司)

1.2 方法

1.2.1 制备不同浓度的药液 用电子分析天平称取0.512 g Ber标准品溶于100 ml无菌ddH2O，配置成5120μg/ml的Ber原液，经过一次性过滤器过滤除菌，连续2倍稀释[14]，分别配制成2560、1280、640 …… 0.3125μg/ml浓度的盐酸小檗碱药液。同理分别配制5120、2560、1280…… 0.3125μg/ml浓度的CIP、LVX及GAT药液。

1.2.2 制备含药MH琼脂平板 将配制好的药液按(药液∶MH琼脂=1∶ 9)比例加入平板中，总量20 ml，即加入递减浓度的Ber、CIP、LVX或GAT药液2 ml，MH琼脂培养基18 mL。同样的，如需两药联用，按比例(Ber+CIP/LVX/GAT：MH琼脂=1∶1∶8)配制总量20 ml的含药MH平板，同时准备空白MH琼脂平板做对照。

1.2.3 测定单药最低抑菌浓度(MIC) 采用微量稀释法[15]，把不同浓度的Ber、CIP、LVX或GAT药液加入至多根含MH培养液的无菌试管中，连续两倍稀释，药液的终浓度为0.0625 μg/ml 至512 μg/ml，加入每管终浓度为1×105CFU/ml的菌液，3种空白对照管做参照(只含MH培养液、只含药液与MH培养液、含菌液与培养液不含药液)，放进37°C恒温培养16～18小时，肉眼见无浑浊的试管中，挑选出含最低药液浓度的试管，此浓度是该药液的MIC。

1.2.4 棋盘法测定两药联用的MIC 采用微量棋盘法[12]，96孔微量板的横坐标按顺序分别加入递增二倍浓度的CIP、LVX或GAT药液，纵坐标加入同等要求的Ber药液，均加入终浓度为1×105CFU/ml的菌液，测定Ber分别与CIP、LVX或GAT联用时的MIC,同样设定3种空白对照管做参照(同1.2.3)，放进37 ℃恒温培养16～18小时，观察各孔液体浑浊程度，同样的挑选肉眼见无浑浊的孔，此浓度是两药联用的MIC。

1.2.5 计算FIC指数 根据两药联用的MIC,计算两药联用时的FIC指数[16]，为两药联用的相互作用提供依据。FIC指数=FIC甲药+FIC乙药=MIC甲药联用/MIC甲药单用+MIC乙药联用/MIC乙药单用。结果判读：FIC指数>2，拮抗作用；1

1.2.6 杀菌曲线的测定并绘制 选取FIC指数为协同或相加作用的KPn 11、KPn 15绘制杀菌曲线图型，实验分组：空白组(MH培养液+菌液)、Ber 512μg/ml组、1/4 MIC CIP+BER 128μg/ml组、1/4 MIC LVX+BER 128 μg/ml组、1/4 MIC GAT+BER 128 μg/ml组。每组终浓度菌液含量约为1×106CFU/ml，37 ℃恒温培养，在0、1、2、4、6、8、12和24小时取样10 μg至MH培养基中，均匀涂开后再次放入37 ℃恒温培养箱中继续培养24小时，观察菌落数并换算log10CFU/ml，以培养时间为横坐标，以菌落数log10CFU/ml为纵坐标绘制杀菌曲线图形。

1.2.7 RT-PCR测定外排泵基因acrA、acrB和tolC的表达量

1.2.7.1 引物的设定 acrA-F:CAGTTTGTTTGTTGTGATCGCC;acrA-R:GCGTCTGTATGAAGGCATTATCC;acrB-F:GCAATCAGTGGAGATCAGCGT;acrB-R:CGGATGTAGTCGGATATATGGT;tolC-F:ATGTGGCTGGCCGAATACCT;tolC-R:TACGGTATAGCATACCGTGT;

1.2.7.2 RT-PCR测定 在1.2.6杀菌曲线测定过程中，实验组与对照组均在细菌的对数生长期，在分光光度计测定OD600约1.2数值时，分别取取约0.4 ml总液体加入0.8 ml RNA protect Reagent，离心，取沉淀物进行RNA的提取，合成cDNA，以16S rRNA作为内参对照,按要求上机行RT-PCR测定acrA、acrB和tolC的表达量，按2-△△CT方法分析。

2 结果

2.1 单用Ber、CIP、LVX或GAT的MIC值

20株KPn菌株单用Ber的MIC值>512 μg/ml为75%(15/20)，≤51 2μg/ml为25%(5/20)均对Ber耐药，CIP、LVX或GAT的MIC值4-512 μg/ml，同样的均对上述药物耐药(表1)。

表1 单用Ber、CIP、LVX或GAT对20株KPn的MIC值

2.2 联用Ber和CIP、LVX或GAT的MIC值和FIC指数

20株KPn菌株联用Ber+ CIP，CIP 的MIC值下降1倍为85%(17/20)，下降2倍或以上为15%(3/20)，无下降为0%(0/20)，Ber的MIC值值下降1倍为65%(13/20)，下降2倍或以上为35%(7/20)，无下降为0%(0/20)，FIC指数为协同作用15%(3/20)，相加作用75%(15/20)，无关作用10%(2/20)；联用Ber+ LVX，LVX的MIC值下降1倍为70%(14/20)，下降2倍或以上为30%(6/20)，无下降为0%(0/20)，Ber的MIC值值下降1倍为60%(12/20)，下降2倍或以上为40%(8/20)，无下降为0%(0/20)，FIC指数为协同作用20%(4/20)，相加作用70%(14/20)，无关作用10%(2/20)；联用Ber+ GAT，GAT的MIC值下降1倍为50%(10/20)，下降2倍或以上为50%(10/20)，无下降为0%(0/20)，Ber的MIC值值下降1倍为30%(6/20)，下降2倍或以上为70%(14/20)，无下降为0%(0/20)，FIC指数为协同作用50%(10/20)，相加作用50%(10/20)，无关作用10%(2/20)(表2、表3、表4)，联用Ber和CIP、LVX或GAT，MIC值较单用时均有下降(P <0.05)，其中Ber与GAT联用，MIC值下降幅度最大及下降的菌株数最多(P <0.05)，Ber和CIP、LVX联用均呈现相加作用为主，但Ber和GAT联用呈现协同作用为主，表示两药联用有更好的抗菌活性，能减少各自的抗菌浓度，Ber和GAT联用更为明显。

表2 联用Ber与CIP对20株KPn的MIC值和FIC指数

表3 联用Ber与LVX对20株KPn的MIC值和FIC指数

表4 联用Ber与GAT对20株KPn的MIC值和FIC指数

2.3 Ber和CIP、LVX或GAT联用对KPn杀菌曲线的影响

选取FIC指数为协同或相加作用的KPn 11、KPn 15制作杀菌曲线，见图1、2。单用Ber 512μg/ml组、1/4 MIC CIP+BER 128μg/ml组和1/4 MIC LVX+BER 128μg/ml组在实验终点(24h)与空白组相比，曲线均有所下降，但差异较小，能抑制细菌生长但效果不明显；1/4 MIC GAT+BER 128μg/ml组与其余各组相比，杀菌曲线下降明显，抗菌活性好，差异有统计学意义(P<0.05)，说明GAT联用BER抑菌效果最佳。

图1 Ber和CIP、LVX或GAT联用对KPn11杀菌曲线图

2.4 RT-PCR测定Ber和CIP、LVX或GAT联用对acrA、acrB和tolC表达量的影响

单用Ber 512 μg/ml组与空白组相比acrA、acrB和tolC表达量有3～5倍升高(P<0.05)，1/4 MIC CIP+BER 128 μg/ml组、1/4 MIC LVX+BER 128μg/ml组和1/4 MIC GAT+BER 128 μg/ml组空白组相比表达量明显升高，15-19倍升高(P<0.05)，也明显高于单用Ber 512 μg/ml组(P<0.05)，但1/4 MIC CIP+BER 128 μg/ml组、1/4 MIC LVX+BER 128μg/ml组和1/4 MIC GAT+BER 128 μg/ml组相比较，表达量无明显差异(P>0.05)(图3)。

图3 Ber和CIP、LVX或GAT联用时的acrA、acrB和tolC表达量

3 讨论

KPn是条件致病菌，致病性强,可引起严重的肺炎、颅内感染、胃肠道感染、泌尿系统感染、皮肤伤口感染、败血症及其他全身性的感染[17]，是临床上常见的病原菌。随着临床抗生素的广泛使用、侵袭性检查的增加、二重感染等等，在我国2017年CHINET细菌耐药性监测数据显示，产ESBLs KPn检出率为27.4%[18]，治疗相当困难。FQNS是广谱的杀菌药物，特别是第三代喹诺酮类药物，如CIP、LVX、GAT等，对大部分革兰阳性菌和革兰阴性菌有良好的抗菌活性，但随着临床上越来越多的革兰阴性菌形成产ESBLs耐药菌株，耐药情况越发严重，是临床治疗上最迫不及待必须攻克的难题。

图2 Ber和CIP、LVX或GAT联用对KPn15杀菌曲线图

我国是植物药大国，研究发现[19-22]，多种植物药物对KPn均有良好的抗菌活性。其中Ber，是一种从黄连中提取的异喹啉生物碱，分子式[C20H18NO4]+Cl-[23]，具有低毒、不易耐药、抑菌作用强等特点的植物性抗菌药物。

本研究通过联用Ber和CIP、LVX或GAT对产ESBLs KPn的MIC值、FIC指数发现，联用Ber后，均能使CIP、LVX或GAT的MIC值下降1倍以上，CIP、LVX主要呈现相加作用，GAT主要呈协同作用。这与既往研究[24-26]相似，Ber与抗生素联用能达到协同或者相加的抑菌效果，从而提高抗生素的抗菌活性。提示单用Ber、CIP、LVX或GAT时，对产ESBLs KPn抑菌能力弱，均呈现耐药状态，但联用Ber后可逆转耐药状态，降低抗菌药物的使用剂量，增强了抗菌药物的抗菌活性，有效抑制产ESBLs KPn的生长，其中GAT联用后的抑菌效应最为明显，为往后的联合抗菌药物的开发奠定有效基础。

通过杀菌曲线观察可发现，当联用Ber时，分别加入只有联用药物MIC值1/4浓度的抗菌药物时，GAT联用组曲线下降最为明显，观察终点(24小时)，产ESBLs KPn菌量最少，能有效抑制KPn生长，其他联用组差异不明显，表示当抗菌药物浓度不足时，Ber仍能增强GAT抗菌活性，达到协同抑菌效应，强有效地抑制细菌生长。我们还发现，前6小时是CIP、LVX或GAT控制KPn生长的关键时间，细菌的对数生长期，是抗菌药物能否起到应有的抗菌效果、细菌生长能否受到有效抑制的关键时刻，如果最终有效抑制KPn生长，0～4小时菌量增加不明显或有下降，并4～6小时菌量生长依然缓慢，如GAT联用组，其他联用组在4～6小时菌量疯狂生长，最终不能抑制细菌生长，所以前6小时是治疗的关键时刻。但单用Ber的观察时间为前8小时，较前延长2小时，证明了单独使用Ber抑菌作用起效较慢，抑菌作用较弱，但达到1/2 MIC浓度时能一定程度上抑制KPn的生长，不易耐药。

Karaosmanoglu K[27]等指出，Ber有效抑制大肠埃希菌生长是因为使其外排泵AcrEF基因表达量升高。而外排泵AcrAB与大肠埃希菌的AcrEF是同源[28]。本研究发现，单用Ber一定程度上抑制KPn的生长，acrA、acrB和tolC表达量轻度升高。CIP、LVX或GAT与Ber联用组表达量明显升高，证明Ber加快了菌体内外排泵的运转速度，快速把抗菌药物泵出体外，但GAT与Ber联用有明显的抑菌效应，与CIP、LVX联用相比有较大的差异，在本研究的外排泵系统的表达中未能找到差异，表明Ber均能增加其他抗菌药物的抗菌活性，并刺激外排泵系统把“有害物质”泵出，从而达到减少菌内抗菌药物的剂量，能继续繁殖。KPn存在多个耐药位点，可能除外排泵系统外的表达量有差异性的变化，仍需进一步深入研究。

Ber联合喹诺酮类抗生素能有效抑制产ESBLs KPn的生长，减少抗生素的用量，减少耐药率的发生，GAT与Ber联用时抗菌作用最为明显，为指导临床产ESBLs KPn的用药提供了重要的依据，但仍需进一步深入明确其分子作用机理。