灵芝多糖的抗氧化作用及其在动物生产中的应用研究进展

彭 聪，黎力之，张进明，关玮琨，廖晓鹏，黄 晓，张海波*，郭冬生*

（1.宜春学院生命科学与资源环境学院，江西省高等学校硒农业工程技术研究中心，江西宜春 336000；2.江西省养蜂研究所，江西南昌 330000；3.青岛市畜牧兽医研究所，山东青岛 266000）

灵芝多糖（Ganoderma Lucidum Polysaccharide，GLP）是灵芝属真菌的菌丝体和子实体的次生代谢产物，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等一种或多种单糖聚合而成[1-2]。GLP 通过改善胰岛细胞功能，抑制机体胰岛素抵抗，并清除体内胆固醇、甘油三酯（Triglyceroles，TG）和游离脂肪酸等物质，调节糖脂代谢[3]。GLP 促进免疫细胞增殖，清除或抑制肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）-α、白介素（IL）-1β、IL-6 等促炎因子产生，提高非特异性免疫和吞噬细胞的吞噬能力，增强机体免疫力[4]。GLP 在调节抗氧化功能方面存在重要作用[5]，动物摄入GLP 后可上调核因子E2 相关因子2（NF-E2-related Factor 2，Nrf2），下调Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated Protein-1，Keap1），介导Nrf2/抗氧化反应元件（Antiox idant Response Element，ARE）信号通路，促进血红素氧合酶 1（Heme Oxygenase-1，HO-1）与醌氧化还原酶-1（NADPH：Quinone Oxidoreductase1，NQO1）生成，清除体内过多自由基、活性氧，增强机体抗氧化功能[6-8]。此外，GLP 可提高动物体中谷胱甘肽过氧化酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和过氧化氢酶（Catalase From Micrococcus Lysodeikticus，CAT）等活性，抑制脂质过氧化，缓解机体炎症反应[9-10]。目前较缺乏有关GLP 在动物抗氧化作用中的系统综述。因此，本文重点阐述GLP 调控Keap1-Nrf2/ARE 通路增强机体抗氧化酶活性以及GLP 在动物生产中的应用，以期为畜牧生产提供理论参考。

1 GLP 概述

1.1 GLP 结构 GLP 是以β-（1,3）-糖苷链为主链，伴有β-（1,4）和β-（1,6）连接的多糖[11]。GLP 一级结构与抗氧化活性高度相关，单糖间以β-（1,3）-和β-（1,6）-或β-（1,4）-和β-（1,6）-糖苷链连接而成的GLP 功能活性最高，但仅以β-（1,4）进行单糖链连接的多糖活性较低[12-14]。此外，GLP 的分子量大小、黏度、分支度、溶解度、化学基团修饰等均影响GLP 抗氧化活性[15]。

1.2 GLP 生物学功能 在调节动物糖脂代谢方面，糖尿病大鼠饲喂400 mg/（kg·d）GLP 14 d 后，显著降低肝脏内磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶蛋白和葡萄糖-6-磷酸酶表达量，血糖浓度降低[16]。200 μg/kg GLP 饲喂高脂模型小鼠28 d 后，血清TG、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低，高密度脂蛋白胆固醇含量显著增加，血脂降低[17]。利用150 mg/kg·d GLP 饲喂肝损伤小鼠10 d后，血清中TG、游离脂肪酸含量显著低于对照组，减少肝脏脂质沉积[18]。在免疫调节方面，GLP 提高动物免疫细胞活性，减少促炎细胞因子产生，缓解炎症反应[19]。研究表明，在乳腺炎症小鼠饲料中添加8% GLP，发现肿瘤坏死因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等细胞炎性因子含量与髓过氧化物酶活性均显著降低，减轻小鼠乳腺炎症反应[20]。此外，GLP 具有还原能力，阻止脂质过氧化物形成[21]。利用200 mg/kg GLP 灌胃四氯化碳溶液诱导的肝纤维化小鼠2 周后，小鼠肝脏丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量下降0.45 nmol/mg pro，说明GLP 能显著降低机体内MDA 含量，缓解脂质过氧化[22]。在改善动物肠道环境方面，GLP 通过增加肠道杯状细胞数量与肠绒毛高度，促进黏蛋白分泌，改善肠道黏膜完整，保护肠黏膜屏障。日粮中添加100 mg/（kg·d）GLP 饲喂免疫抑制小鼠后发现，空肠绒毛高度和隐窝深度显著增加，小肠消化吸收效率增强，免疫力提高，促进机体健康[23]。研究发现，利用100 mg/（kg·d）黑灵芝多糖饲喂SPF级雌性小鼠，小鼠空肠组织中杯状细胞数量和平均每根绒毛黏液面积分别较模型组高50% 和75%，黏蛋白分泌增加，抑制溃疡性结肠炎发生[24]。

2 GLP 抗氧化作用机制

2.1 GLP 介导Keap1-Nrf2/ARE 通路增强机体抗氧化功能Nrf2是Keap1-Nrf2/ARE 通路中关键调控因子，其表达的Nrf2 蛋白是机体氧化应激的感受器，通过与ARE 相互作用，调控多种抗氧化酶和II 相解毒酶基因表达，增加HO-1、NQO1、SOD 等含量，清除过量自由基和脂质过氧化物，提高机体抗氧化功能。GLP 进入细胞后能上调Nrf2基因表达，下调Keap1基因表达，Nrf2 与Keap1 蛋白解偶联，释放Nrf2 进入细胞核[6]。Nrf2 与核内Maf 蛋白形成异源二聚体后与ARE 结合，激活HO-1、SOD和NQO1基因表达，在细胞防御系统中扮演关键角色[25]。Lee 等[26]研究GLP 对过氧化氢（Hydrogen Peroxide，H2O2）诱导小鼠成肌细胞损伤修复中发现，在处于1 mmol/L H2O2中的成肌细胞中添加50 μg/mL GLP，细胞核中Nrf2 含量显著增加，体系中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）含量显著降低，细胞存活率提高至81.7%，且Nrf2基因表达程度与GLP 处理时间和浓度呈正比。综上表明，GLP 能促进Nrf2 蛋白生成，激活Nrf2/ARE 通路，提高动物抗氧化功能。

HO-1与NQO1是Keap1-Nrf2/ARE 信号通路的下游基因，HO-1 蛋白可以清除过量自由基、过氧化物和过氧亚硝酸盐，缓解氧化应激；NQO1 可以催化醌还原成氢醌并抑制ROS 产生，防止DNA 氧化损伤[27]。GLP 可通过激活Nrf2，上调机体中HO-1与NQO1基因表达，实现抗氧化功能调控[10]。研究发现，敲除小鼠成肌细胞Nrf2基因后，HO-1基因表达下降，说明Nrf2 对HO-1基因表达具有促进作用[26]；在H2O2诱导小鼠成肌细胞损伤试验中添加GLP 发现，Nrf2表达上调引起HO-1 含量增加，降低机体中自由基水平，保护细胞免受氧化损伤[26]。Li 等[10]发现，在高剂量GLP 400 mg/kg·d 干预下，2 型糖尿病小鼠体内Nrf2 与HO-1 蛋白表达水平显著提高，增强了GSH-Px、SOD等抗氧化酶活力。因此，GLP 可激活Nrf2，促进HO-1基因表达，降低自由基、ROS、过氧化硝酸盐含量，提高机体抗氧化功能。同时，GLP 还能促进NQO1基因表达。研究发现，利用2.5 g/L GLP 处理成纤维细胞，显著提高细胞中NQO1 蛋白表达量，CAT、SOD、GSH-Px等含量显著增加，且ROS 与MDA 含量显著减少，缓解细胞氧化损伤[6]。Hsieh 等[28]研究发现，用10 mg/mL富含GLP 的灵芝乙醇提取物处理卵巢细胞72 h 后，细胞核中Nrf2 蛋白水平与稳定性显著提高，NQO1 蛋白表达水平提高2.4 倍，SOD 表达相较于对照组增加2.87倍，过氧化氢酶提高2.51 倍，说明GLP 具有上调Nrf2与NQO1基因表达、增加抗氧化酶含量的作用及提高卵巢细胞抗氧化能力。综上所述，在Keap1-Nrf2/ARE抗氧化通路中，GLP 上调关键调控因子Nrf2基因表达，同时抑制Keap1基因表达，促进Nrf2/ARE 通路下游HO-1和NQO1基因表达，提高HO-1、NQO1、SOD和GSH-Px 等抗氧化酶蛋白含量，清除过量自由基等，从而缓解氧化应激对机体的刺激，提高动物抗氧化能力（图1）。

图1 GLP 对机体抗氧化功能的调控作用

2.2 GLP 增强机体抗氧化酶活性 机体中过多自由基使DNA 双链结构受损或断裂，引起细胞内糖类、脂质和蛋白质变性，破坏生物膜系统，造成内质网与线粒体应激，诱导细胞凋亡，影响机体正常生命活动[29]。GLP 可增加SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶含量与活性，清除羟基自由基、超氧阴离子和1,1-二苯基-2-三基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）等过量自由基，缓解机体氧化应激[30-31]。在研究小鼠急性肾脏损伤中发现，添加灵芝多糖肽能提高SOD 活力，减少细胞色素C 与内质网应激标志蛋白含量，降低ROS 等自由基产生氧化损伤，改善内质网与线粒体应激水平[32]。在肝脏氧化损伤恢复试验中添加黑灵芝多糖能提高机体GSH-Px 和CAT 活力，降低谷草转氨 酶（Aspartate Transaminase，AST）、谷丙转氨酶（CerealthirdtranSaminase，GPT）和TG 含量，使肝索断裂、核仁固缩与胞质丢失恢复，缓解肝脏氧化损伤[33]。研究发现，过多ROS 刺激机体发生氧化应激，产生炎症反应，在小鼠腹腔巨噬细胞培养液中添加GLP 后，巨噬细胞中ROS、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和IL-1β表达水平显著下降，IL-10 含量上升，表明GLP 能抑制巨噬细胞向M1 表型转化，促进其向M2 表型转化，减少炎症因子产生，增加抗炎因子生成，缓解炎症反应[34]。利用200 mg/kg BW 富含GLP 的灵芝提取物处理经四氯化碳损伤小鼠发现，机体中SOD、CAT 活力显著提高，ROS 和超氧阴离子清除能力增强，坏死细胞和炎症细胞减少，恢复了肝组织窦状扩张，维持肝脏正常机能[35]。在动物体中，由于脂质含有大量不饱和脂肪酞链，因此易被氧化产生过氧化物。研究发现，GLP 能与脂质过氧化反应中产生的ROS 结合，防止或减缓自由基攻击细胞膜中多不饱和脂肪酸，抑制脂质过氧化反应[27]。将GLP 添加至大豆卵磷脂SPC 制备的脂质体60 h 后，GLP 脂质体仅产生8 ng MDA，是对照组的1/3，GLP 脂质体产生的过氧化物是对照组的1/9，表明GLP 能有效延缓或阻止脂质过氧化反应，提高机体抗氧化能力[21]。总之，GLP 能提高SOD、GSH-Px、CAT 等抗氧化酶活性，降低自由基、MDA 与炎症因子对机体的损伤，提高机体抗氧化能力，维持动物细胞、组织和器官正常生理功能。

3 GLP 在动物生产方面的应用

3.1 单胃动物 在家禽方面，GLP 增强GSH-Px 抗氧化酶活性，清除过氧化氢、过氧化脂质（Lipid Peroxides，LPO）和MDA 等脂质过氧化物，降低氧化应激水平，增强动物免疫机能，提高生产性能。研究显示，富含GLP 的灵芝粉饲喂肉鸡35 d 后，肝和脾内GSH-Px 与谷胱甘肽还原酶含量与活力显著增加，显著降低肝内LPO 和MDA 含量，表明GLP 能增强机体抗氧化功能，缓解氧化应激对机体产生不良影响[36]。GLP 还通过调节免疫细胞增殖与活性，提高免疫因子与抗体含量，增强动物抗病能力，改善饲料利用率，进而提高家禽生产性能[37-38]。研究发现，利用0.2 mL GLP 饲喂镉中毒雏鸡68 d 后发现，鸡胸腺与法氏囊中TNF-α、IL-1β、IL-6等因子含量显著低于对照组，说明GLP 具有缓解雏鸡镉中毒、增强动物免疫力的作用[37]。

在猪方面，GLP 可增强公猪精子活力，显著降低精子MDA 含量，提高SOD、CAT 和GSH-Px 的活性，保护顶体与质膜不被氧化，提高公猪繁殖性能。在常温保存液中添加浓度为0.4 mg/mL 的GLP 保存猪精子6 d后，精子活力、顶体完整率和质膜完整率均显著高于对照组[39]。GLP 还能降低炎症因子分泌，提高机体中免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）含量，增强免疫力。利用0.2% GLP 饲喂育肥猪70 d 后发现，血清中炎症因子IL-1β水平降低，IgG 浓度增加36.1%，表明GLP 具有提高机体免疫水平的作用[40]。利用800 mg/kg GLP 饲喂仔猪35 d 后，血清中IgG 和IL-2 浓度分别增加了33%和24%，白蛋白与球蛋白的比值显著降低，改善了仔猪免疫力，提高了猪生产性能与肉品质[41]。研究发现，灵芝多糖-乳酸菌合生元饲喂产子母猪后发现，母猪总采食量提高13.18%，平均增重比对照组多4.0 kg/窝，仔猪腹泻率降低8.07%，说明灵芝多糖-乳酸菌复合能够维持肠道菌群结构稳定，增加猪采食量，提高动物平均日增重、存活率等生产性能[42]。

3.2 反刍动物 在抗氧化方面，GLP 可增强机体SOD、GSH-Px 活性，清除MDA，缓解氧化应激。在奶牛饲料中加入富含GLP 的菌草灵芝发酵菌质37 d 后，发现血清中MDA 含量比对照组下降13.19%，机体SOD、GSH-Px 等酶活性提高，奶牛抗氧化能力提升[43]。在免疫方面，GLP 还能促进机体生成IgG、IgA、IgM 等免疫球蛋白，增强免疫力，增加产奶量，提高生产性能。利用3 kg 富含GLP 的鲜菌草与灵芝丝发酵菌质替代等量青贮饲料饲喂处于泌乳中期的奶牛后，乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、非脂乳固体较对照组提高了2.24%、3.7%、1.9%、1.7%，奶牛血清中矿物质元素、免疫蛋白、TG等生化指标均处于正水平，改善了牛乳品质，并提高了奶牛生产性能[44]。在调控瘤胃内环境方面，饲料中添加200 g 富含GLP 的菌草灵芝菌糟饲喂1 d 后，瘤胃液中原虫数量比对照组少1.11×106个/mL，改善了奶牛对能量以及氮源的利用率，增加了奶牛产奶量，提高了生产性能[45]。综上所述，GLP 具有提高反刍动物GSHPx、SOD 和CAT 等酶活性，清除MDA 等脂质过氧化产物，增加免疫因子含量，降低炎症因子生成，调节机体抗氧化与免疫机能。此外，GLP 还可调节瘤胃菌群结构，提高奶牛的产奶量以及延缓泌乳中期产奶量下降的作用。

3.3 水产动物 GLP 可提高水产动物CAT、SOD 等抗氧化酶、酸性磷酸酶（Acid Phosphatase，ACP）和碱性磷酸酶（Alkaline Ahosphatase，AKP）活性，加强机体对营养物质的吸收代谢，提高生产性能。Liu 等[46]在研究GLP 对鲤鱼肝损伤恢复中发现，体外肝细胞经0.6 mg/mL GLP 处理后，SOD、GSH-Px 和CAT 含量较对照组显著提高，MDA、AST 与GPT 含量显著降低，表明GLP 能提高肝细胞抗氧化能力，降低氧化应激水平，保护肝脏。研究发现，ACP 与AKP 参与机体营养运输、蛋白质合成和生长等代谢活动，在饲料中添加2.5 g/kg GLP 饲喂罗氏沼虾90 d 后，与对照组相比，罗氏沼虾肌肉、肝胰腺中AKP 与ACP 含量显著增加，特定生长速率提高了0.38%/d，采食量与蛋白质效率比也显著提高，体长、体重均值分别增加1.22 cm 和0.93 g，说明GLP 能加强机体内营养物质代谢，促进生长发育，提高生产性能[47]。此外，用含1.5 g/kg GLP 的日粮饲喂罗氏沼虾60 d 后，罗氏沼虾存活率相对于对照组提高9.35%，嗜水气单胞菌感染死亡率显著降低，比生长速率显著提高，说明GLP 在机体内能作为潜在能量来源，有利于营养物质的积累，促进机体生长发育，维持机体健康[48]。

4 小结与展望

GLP 具有提高机体抗氧化酶活性、清除自由基、降低炎性细胞因子分泌的作用，主要表现在2 个方面。①在Keap1-Nrf2/ARE 通路中：GLP 上调Nrf2基因表达，下调Keap1基因表达，抑制Nrf2 与Keap1 结合，促进Nrf2 释放进入细胞核，进而上调下游HO-1和NQO1基因，提高抗氧化酶含量与活力，清除自由基。②GLP可通过上调机体抗氧化酶相关基因表达，提高内源性酶含量与活力，从而清除多余自由基，缓解氧化损伤；GLP 还可以降低ROS 对机体的氧化作用，阻断脂质过氧化反应进程。目前，GLP 作为优质饲料添加剂广泛应用于动物生产，有效提高机体免疫力、生产性能、抗应激与抗氧化能力；还可作为辅助药物缓解肝脏、肾脏等器官损伤，在动物氧化损伤治疗方面具有潜力。此外，GLP 作为抗氧化添加剂在延长畜禽精子保存时间上具有良好效果。但对于GLP 是否参与更多抗氧化通路尚未明确，还需进一步深入探究。