单头柑桔木虱中黄龙病菌快速检测方法建立与应用

黄爱军，顾佩佩，胡 燕，丁 敏，王 莹

(1 赣南师范大学生命科学学院，江西赣州，341000；2 国家脐橙工程技术研究中心，江西赣州，341000；3 江西省赣州市果业局，江西赣州，341000)

柑桔黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是当今柑桔生产中最具毁灭性的病害，可以为害柑桔类所有栽培品种[1]。在我国，HLB主要由韧皮部杆菌亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus, CLas)引起。柑桔植株一旦感病，果实品质和产量均会受到严重影响，幼树一般在发病后2～3年内死亡，成年树一般在5～8年内死亡或丧失经济价值。目前，只能通过砍除田间病树、种植无病毒苗木和防控田间媒介昆虫的方式控制黄龙病的蔓延。

柑桔木虱是HLB田间最主要传播介体昆虫。一个园区一旦监测到带病柑桔木虱，一般在半年到3年时间内，会检测到带病植株，随后逐渐扩散到全园[2]。柑桔木虱以持久型方式传播CLas，黄龙病菌可在柑桔木虱体内增殖，一旦带毒终身传毒[3]。因此，在HLB防控过程中，有必需对单头柑桔木虱中的黄龙病菌进行监测。目前，有多种方法可检测单头柑桔木虱中的黄龙病菌，但所需时间较长，且需要核酸扩增仪器等设备[4-6]，难以普及推广到基层病害防控部门。核酸环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)是一种快捷、灵敏的恒温扩增技术，降低了对于仪器的要求，适宜基层部门使用。目前已建立了针对病原菌外膜蛋白基因、16S rDNA基因、假定蛋白基因的柑桔黄龙病LAMP检测方法，检测极限可达1 pg/μL[7-10]。DNA模板的提取也是检测环节中耗时较多的一个环节。有研究结果显示，采用Direct-PCR制样法即通过组织裂解提取样品粗核酸用于后续检测，大大缩短了检测过程[11]。笔者开展了将快速裂解制样方法和LAMP技术相结合进行单头柑桔木虱黄龙病菌检测的研究，旨在提高单头柑桔木虱黄龙病菌检测效率和灵敏度。

1 材料与方法

1.1 柑桔木虱样品

携带及不带CLas的柑桔木虱，均饲养于国家脐橙工程技术研究中心负压实验室。田间柑桔木虱采集于江西省赣州市瑞金县武阳镇、会昌县麻州镇和于都县罗坳镇的疑似感病果园。

1.2 主要试剂

动物组织直接PCR试剂盒(TP-01111)

表1 试验所用引物及其序列

购于成都福际生物技术有限公司。Bst2.0 DNA聚合酶购自NEB公司。甜菜碱购自sigma公司。10 mmol/L浓度的dNTP溶液购自TaKaRa公司。SYBR Green Ⅰ(10 000×) 购自Solarbio公司。2× Taq Plus Master Mix购自近岸蛋白质科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master购自Roche公司。试验所用引物序列信息见表1，均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 试验方法

1.3.1 单头柑桔木虱裂解制样 参照动物组织直接PCR试剂盒说明书，略有改动。将单头柑桔木虱样品放入0.2 mL离心管中，加入试剂盒中Buffer AL 50 μL、Foregene Protease 2 μL，磨碎样品组织，研磨液在65 ℃恒温裂解10 min，裂解完成后，取上清液做扩增模板。

1.3.2 LAMP扩增方法比较 对3种已建立的柑桔黄龙病菌LAMP检测方法的扩增时间和检测灵敏度进行比较，黄丽等[8]的方法简称为方法1，Rigano等[10]的方法简称为方法2，彭军等[9]的方法简称为方法3，反应体系参照相应文献。扩增时间比较时，以相同的带菌柑桔木虱样品核酸裂解液为模板，分别在10、20、30、40、50、60 min扩增时间下扩增。检测灵敏度比较时，采用CTAB法[15]抽提柑桔木虱总核酸，通过Nanodrop 2000测定所得核酸浓度，以浓度为203.6 ng/μL的带菌柑桔木虱核酸模板进行10倍梯度稀释，65 ℃扩增60 min。反应结束后，分别进行荧光显色和电泳观察。荧光显色观察为扩增完成后加入1 μL 10 000× SYBR greenⅠ染料震荡混匀可直接观察(加染料略微震荡混匀即可观察，阳性和阴性样品颜色差异可通过肉眼明显分辨，个别难以辨别样品可置于300 nm紫外光下观察是否发出荧光)。

1.3.3 普通PCR、实时定量PCR检测 普通PCR反应体系：2× Taq Plus Master Mix 10 μL，10 μmol/L正向引物/反向引物各0.5 μL，裂解所得粗提核酸模板(裂解制样所得上清液) 1.0 μL，灭菌ddH2O 8 μL。扩增反应程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性20 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸80 s，35个循环。PCR反应结束后，取5 μL产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行条带检测。

实时定量PCR反应体系：FastStart Universal SYBR Green Master 10 μL，10 μmol/L正向引物/反向引物各0.5 μL，裂解所得粗提核酸模板(裂解制样所得上清液)1.0 μL，灭菌ddH2O 8 μL。扩增反应程序为：95 ℃预变性20 s，95 ℃变性5 s，58 ℃退火40 s，40个循环。退火延伸阶段自动采集荧光。熔解曲线程序为：94 ℃，60 s，55 ℃，60 s；然后从55 ℃开始每升高0.5 ℃保持10 s，连续升高80次。

1.3.4 田间样品检测 田间柑桔木虱样品采集于瑞金武阳镇、会昌麻州镇、于都罗坳镇3个果园，均确认有黄龙病病株，每个果园采集100头，共300头柑桔木虱。柑桔木虱样品进行组织裂解提取核酸后，分别采用普通PCR、LAMP及实时定量PCR方法检测携带黄龙病菌的情况，比较不同检测方法检出的带菌率。

2 结果与分析

2.1 3种LAMP检测方法扩增时间及灵敏度的比较

不同扩增时间比较结果显示，方法2在扩增时间为20 min时即可观察到微弱的扩增条带，当扩增时间延长至30 min时扩增条带明亮清晰，当继续延长至40 min时目测扩增条带亮度无明显改变；方法1在扩增时间为50 min时可观察到微弱的扩增条带，当延长至60 min时才能观察到明亮清晰的扩增条带；方法3直到将扩增时间延长至90 min时才可观察到明亮清晰的扩增条带(见图1)。灵敏度比较试验中，方法1、2的检测灵敏度分别在模板(203.6 ng/μL)稀释至10-1和10-3，方法3在相同扩增时间(60 min)内未能检测出病原(见图1)。荧光显色结果与电泳结果相同，多次重复试验结果相同。因此，选择方法2和扩增时间30 min开展后续检测试验。

图1 3种LAMP扩增方法的扩增时间和灵敏度比较

2.2 LAMP与其他检测方法的比较

应用革兰氏阴性细菌通用引物27F/1492R对单头柑桔木虱裂解制样所得模板(上清液)进行PCR扩增，可获得一条1 500 bp左右的扩增条带，条带清晰明亮。由此可见，通过简单裂解制样所得上清液，可用于后续检测试验。应用黄龙病菌特异性引物OI1/OI2c进行PCR扩增，检测柑桔木虱样品是否携带有黄龙病菌，发现在22份样品中11份样品有特异性扩增条带，另外有个别样品扩增条带不清晰、难以辨认。然而，使用LAMP扩增方法(方法2，扩增30 min)，在22份样品中，16份样品有清晰且明亮条带扩增。染料法所得结果与电泳结果一致(见图2)。为防止LAMP扩增结果假阳性的出现，通过实时定量PCR的方法再次对以上22份样品进行检测，检出阳性样品16个，与LAMP检出结果一一对应。这说明，所用LAMP检测方法与实时定量PCR具有相同的灵敏度，能够更大程度地检出带菌柑桔木虱样品，而普通PCR方法则可能会出现假阴性结果。

图2 不同检测方法灵敏度比较

2.3 田间样品检测

300头取自不同地点的柑桔木虱田间样品采用裂解法制样后，分别采用普通PCR、LAMP(方法2，扩增30 min)和qPCR方法检测带菌率。普通PCR检测出的带菌率在3%～17%；LAMP和qPCR两种方法检出结果能够一一对应，检出的带菌率一致且高于普通PCR法(见表2)。可见，针对田间柑桔木虱样品(裂解法制样)，采用LAMP和qPCR扩增方法可有效提高带菌柑桔木虱的检出率，而采用普通PCR的检测方法可能会出现假阴性结果(即出现漏检)。

表2 田间柑桔木虱样品采用不同方法检测柑桔黄龙病菌的带菌率 %

3 讨论与结论

柑桔木虱是柑桔黄龙病田间传播的主要媒介昆虫，监测田间柑桔木虱的带毒率对于病害防控具有重要意义，因此需要建立一种快速、简捷、准确的检测方法。本研究采用的快速裂解制样法，所需样品量少，操作简单，无需液氮研磨，获得的上清液(粗提核酸)可作为检测模板，用于后续进一步黄龙病菌检测，与以前报道的柑桔木虱快速制样方法[4-6]相比，耗时更短，操作更简便。本研究还比较了CaLas的3种LAMP检测方法，发现以假定蛋白为靶标的LAMP法灵敏度最高[10]，且扩增所需时间最短。可能是由于该方法增加了环引物，提高扩增效率，减少了扩增时间。通过比较分析普通PCR、LAMP和qPCR法对田间样品的检测结果发现，普通PCR的阳性检出率低于其他两种方法，会存在漏检现象；LAMP和qPCR的检测结果一一对应，阳性检出率完全一致。相比而言，LAMP方法的扩增时间短，对扩增仪器要求较低，因此更适用于基层检测部门。

本研究将快速裂解制样与LAMP技术相结合，裂解制样10 min，LAMP扩增30 min，直接荧光显色观察结果，在45 min内即可完成单头柑桔木虱样品的检测，操作简便，缩短了病原检测时间，为病害传播介体检测提供了一种快速、可靠的方法。