针刺对急性脑出血大鼠Nrf2/ARE信号通路关键因子表达的影响*

戴晓红，于学平，匡炳霖，滕 伟，于薇薇，马慧慧，陈秋欣，邹 伟△

(1.黑龙江神志医院，黑龙江 哈尔滨 150000； 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)后继发的脑组织损伤是影响预后、转归的关键因素[1]，而炎性反应、氧化应激等一系列级联反应对脑出血后继发性脑损伤起决定性作用。活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)引起的氧化应激损伤成为继发性脑损伤的重要原因之一[2-3]，在中枢神经系统疾病的发病机制起关键作用[4-5]。研究认为，脑出血后，为了抑制氧化应激损伤，体内内源性抗氧化系统激活，从而发挥保护脑细胞的作用。转录调节因子2/抗氧化元件(Nrf2/ARE)信号通路是体内最重要的内源性抗氧化通路[6-7]。脑出血后血肿周围迅速发生氧化应激反应，Nrf2通过磷酸化与胞浆蛋白(Kelch-like ECH-associated protein-1， Keap1)发生解离，进入细胞核，与抗氧化元件(Antioxidant respon-sive element， ARE)序列结合，从而调控其下游的靶蛋白血红素加氧酶1(NF-erythroid 2-related factor 2，HO-1)、醌氧化还原酶1(Heme oxygenase 1，NQO1)等抗氧化酶和解毒酶的表达，保护脑细胞免受氧自由基等活性物质的侵害[8-10]。

针灸在中风后的治疗中显示出较好的疗效，大量研究显示，针刺具有拮抗脑水肿、修复和重塑受损神经、减轻炎性反应和防治脑损伤等作用，针刺可以通过多靶点干预，明显降低脑出血大鼠神经缺损的程度，明显恢复大鼠的神经功能[11]。本实验观察“百会”透“曲鬓”头针疗法对Nrf2/ARE信号通路上转录调节因子2(Quinone oxidoreductase1，Nrf2)、HO-1和NQO1表达的影响，探讨该疗法拮抗脑出血后脑组织氧化应激损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级健康雄性Wistar大鼠54只，体质量280～320 g，实验动物购买于黑龙江中医药大学实验动物中心[动物质量合格证书号：SCXK(黑)2016-015]。大鼠均分笼饲养，在安静环境下，给予正常温控、光照，室温20～23 ℃，湿度50%～60%，自由饮水。造模前禁食12 h，禁水6 h。所有程序均按照国家卫生研究所实验动物护理和使用指南执行。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 仪器 立体定位仪(STW-1型，中国成都仪器厂)；台式牙钻机(307-6型，中国上海齿科医械厂)；电热恒温干燥箱(德国梅尔特公司)；组织匀浆器( 瑞士Fluka公司)；蛋白电泳转膜仪(美国Bio-RAD公司)。

1.2.2 试剂 BCA定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司);小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(sc-130301,Santa cruz公司);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天公司);兔抗大鼠Nrf2多克隆抗体(sc-722,Santa cruz公司);兔抗大鼠HO-1多克隆抗(2322-1,Epitomics公司);兔抗大鼠NQO1多克隆抗体(sc-2591,Santa cruz公司)。

1.3 动物分组、造模方法

54只大鼠适应性饲养7 d后，采用随机数字表分为针刺组、模型组和假手术组，再将各组按照1 d、3 d和7 d不同时间分为3个亚组，每个亚组6只大鼠。参照大鼠脑立体定位图谱[12]，根据Rosenberg[13]方法制作。给大鼠腹腔内注射10%水合氯醛(350 mg/kg)进行麻醉。大鼠采取俯卧位，在立体定位仪上被固定。头部备皮消毒，沿头颅正中纵行切开约1 cm长度切口，充分暴露前囟及冠状缝，用牙科钻于右侧尾状核的体表定位点(前囟点)右旁开3.5 mm、后0.2 mm处，钻一个直径为1.0 mm的圆孔，深达硬脑膜表面。鼠尾消毒后，距离鼠尾末梢3 cm处将其剪断，用微量注射器取血50 μL。将微量注射器固定在立体定位仪上，将微量注射器的针头沿钻孔进针约6 mm，以25 μL/min速度将大鼠血液50 μL缓慢推进尾壳核，留针观察约5 min，然后缓慢出针。牙科水泥封闭，缝合，消毒。常规脱水、浸蜡和包埋。

1.4 模型筛选

依据Berderson[14]评分法对造模后大鼠进行评分，评分>1分者即为出现神经功能缺损体征。再经取脑证实颅内存在明确血肿，则被作为脑出血成功模型。

1.5 干预方法

1.5.1 针刺组 大鼠于脑出血造模成功12 h后，对其进行针刺干预。针刺部位参照《实验动物穴位图谱》，取大鼠患侧百会穴(顶骨正中)、曲鬓穴(右眶外缘与右外耳口连线的后2/3)。针刺方法：采取由百会穴向曲鬓穴透刺的方法，选用0.30 mm×25 mm毫针针刺，进针20 mm，留针30 min，留针期间以3～4 r/s的速度进行3次捻针，每次5 min。每天针刺1次，按1 d、3 d和7 d时间点进行分组治疗。

1.5.2 模型组 动物不接受任何干预，仅按要求制作脑出血模型。造模成功后，每天对大鼠进行1次与针刺组相同的捆绑，每次30 min。

1.5.3 假手术组 动物要经过麻醉、固定、定位及取血等步骤，但不进行注血，不做任何干预。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠行为学检测 采用Longa评分法[15]对术后1 d、3 d和7 d大鼠进行评分，以确定其神经缺损程度，其评分越高表示运动障碍越重。具体方法如下：0分：没有任何神经功能缺损；1分：病灶对侧前爪不能完全伸展；2分：爬行时无法走直线，向病灶对侧划圈；3分：行走时向病灶对侧倾倒；4分：无法自发行走，存在意识障碍。

1.6.2 脑组织中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达

1.6.2.1 标本采集 各组大鼠在相应时间点干预后进行取材。使用4%水合氯醛过量麻醉大鼠，开胸腔暴露心脏，经左心室插管至升主动脉根部，在右心耳处剪一小口，迅速将生理盐水300 mL经左心室插管灌注冲洗血液，再灌注4%多聚甲醛(PH7.2～7.4)300 mL，待大鼠肝脏及肢体变硬后断头取脑。剥离大鼠脑组织，距头部血液注射点前后各2 mm冠状切下厚度4 mm的脑片，保存在含有1‰DECP的4%多聚甲醛固定液中。

1.6.2.2 检测Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达 采用Western blot法检测各组大鼠Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表达，取血肿灶周区域4 g组织，加入PIRA 裂解液用匀浆机研磨粉碎，离心制成上清液。经过BCA测好蛋白浓度后，取出适量的上清液制备成样品储存液。取适量的样品储存液加入电泳槽内进行电泳，转膜，封闭。分别加入一抗：Nrf2抗体(1∶1 000)、HO-1抗体(1∶1 000)、NQO-1抗体(1∶1 000)、及β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。清洗后的膜用二抗(1∶15 000)孵育1 h，洗涤后缓慢摇动洗涤10 min×3次。最后进行扫描，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值，目的蛋白与β-actin灰度值得比值即为需要测定的蛋白量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

表1示，假手术组大鼠各个时间点未见任何神经功能缺损症状。模型组术后1 d即出现明显的神经功能缺损；术后3 d，神经功能缺损最重；术后7 d，神经功能缺损较高峰时减轻，症状逐渐好转。模型组与假手术组对照，各时间点差异有统计学意义(P<0.01)。针刺组大鼠各个时间点神经功能缺损评分都明显降低，症状均有明显改善，与同期模型组对照，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠神经功能缺损体征Longa评分比较

2.2 各组大鼠脑组织Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达比较

表2～4和图1示：假手术组各时间点Nrf2、HO-1和NQO1蛋白呈少量表达，各时间点各蛋白表达差异无统计学意义(P﹥0.05)。 模型组在术后1 d即检测出Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达升高，术后3 d达高峰，至术后7 d峰值有所回落，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。针刺组各时间点Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达较模型组均有明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表2 各组大鼠不同时相点Nrf2 Western blot结果比较

表3 各组大鼠不同时相点HO-1 Western blot结果比较

表4 各组大鼠不同时相点NQO1 Western blot结果比较

图1 各组大鼠脑组织Nrf2、HO-1及NQO1蛋白条带

2.3 各组大鼠脑组织中Nrf2与HO-1、Nrf2与NQO1相关性分析

图2～3示,Nrf2与HO-1回归方程式：Y=0.104+0.819X，R2=0.862，二者呈正相关。Nrf2与NQO1回归方程式：Y=0.136+0.696X，R2=0.883，二者呈正相关。

图2 各组大鼠脑组织Nrf2与HO-1相关性分析

图3 各组大鼠脑组织Nrf2与NQO1相关性分析

3 讨论

脑出血属于中医学“中风病”的范畴，中医学认为本病病机多是肝肾亏损、阴阳失调和气血上逆兼有风火痰瘀，瘀滞经络所致，属于本虚标实之证。以往研究结果显示针灸治疗中风类疾病具有很好的效果，其中头针疗法治疗中风病的疗效尤为突出。早在《针灸大成·玉龙歌》中就有“中风不语最难医，发际顶门穴要知，更向百会明补泻，实时苏醒免灾危”的记载。《普济方》指出：“凡忽中风，言语謇涩，半身不遂……穴百会，耳前发际曲鬓穴”。本实验是在导师邹伟教授多年临床经验与实验研究的基础上，采用“百会”透“曲鬓”头针疗法，进一步研究该头针疗法对大鼠脑出血急性期氧化应激损伤的拮抗作用。

氧化应激是指体内氧化与抗氧化系统失衡，机体对氧化物的清除能力下降，导致细胞凋亡和组织损伤[16-17]。氧化应激已被确定为ICH继发性损伤的重要发病机制，不仅涉及ICH的病理过程，还参与了ICH病理生理反应的多个重要阶段[18]。国内外的研究证实，Nrf2/ARE信号通路作为机体最重要的内源性抗氧化信号通路[19]，参与体内氧化应激反应[20]，是抵御外源性刺激和毒物的防御性转导通路[21]。大量实验研究证实[22]，建立Nrf2基因敲除小鼠脑出血模型，与Nrf2基因未敲除小鼠脑出血模型对照，结果显示：前者血肿周围白细胞浸润增多、血肿体积增大，DNA损伤加重及ROS产生增多[23-24]。Yan等[25]制作大鼠右侧顶叶脑皮层挫裂伤模型，RT-PCR结果显示，外伤组HO-1和NQO1 mRNA水平上调；Western blot结果显示，外伤组细胞核内Nrf2蛋白水平较对照组显著升高；免疫组化结果显示，外伤组较对照组Nrf2和HO-1表达增多。提示Nrf2-ARE通路在脑外伤中具有保护作用。Li等[26]制作急性ICH大鼠模型，结果显示：NQO1、HO-1、SOD和GSH-Px等抗氧化酶的表达随着Nrf2表达增多而增多，说明Nrf2可上调上述抗氧化酶的表达。因此，Nrf2-ARE通路具有保护神经损伤的作用。

本实验采用Longa评分法，综合评价大鼠神经功能缺损程度。针刺组大鼠在1 d、3 d和7 d的神经功能缺损评分都较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。随着针刺效应的逐渐积累，大鼠神经功能缺损症状均有明显改善。由此可见，对脑出血急性期大鼠给予“百会”透“曲鬓”针刺疗法，能明显改善大鼠神经功能缺损症状，促进大鼠神经功能的恢复。观察各组大鼠不同时间点脑组织中Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表达情况。结果显示：假手术组大鼠可见少量Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达。术后1 d，模型组大鼠即有相当数量表达，术后3 d达到最高值，术后7 d降低。说明脑出血后即存在Nrf2-ARE信号通路的激活，也说明脑出血后继发性脑损伤的病理过程中存在Nrf2及其下游靶蛋白HO-1、NQO1的参与。针刺组大鼠Nrf2、HO-1和NQO1蛋白在1 d、3 d和7 d表达的趋势与模型组相同，其每个时间点均高于模型组。这表明针刺能够促进脑出血大鼠Nrf2、HO-1和NQO1蛋白的表达，从而起到保护脑细胞、减少脑组织继发性损伤的作用。

本实验通过对Nrf2、HO-1和NQO1之间进行了相关性分析，得出Nrf2与HO-1的表达呈正相关，Nrf2与NQO1的表达呈正相关，而针刺“百会”透“曲鬓”可以促进Nrf2、HO-1和NQO1的表达，它们之间相互协同参与对抗脑出血氧化应激损伤。由此说明这种神经保护作用机制发挥可能与Nrf2-ARE信号通路激活后，调控其下游的靶蛋白HO-1、NQO1的表达有关。

从上世纪90年代末开始，导师邹伟教授一直在研究针刺“百会”透“曲鬓”穴治疗脑出血。邹伟教授科研团队从组织形态学、神经营养因子、炎性反应、细胞凋亡和神经重塑机制等[27-29]方面进行了大量的实验研究，进一步证实了“百会”透“曲鬓”针刺法对脑出血后脑组织损伤有保护和修复作用。本实验在前期实验的基础上，进一步探讨了“百会”透“曲鬓”针刺法对Nrf2-ARE信号通路的作用机制,证实该针刺法可以明显降低脑出血大鼠脑组织缺损评分，改善大鼠神经缺损症状,也阐明了该针刺法可以激活机体内源性抗氧化通路，从而拮抗氧化应激损伤，发挥脑保护作用，为脑出血的临床治疗及针刺机理的进一步研究提供了新的思路。

由于技术条件的限制，本研究未在Nrf2、HO-1及NQO1基因敲除大鼠模型中验证“百会”透“曲鬓”头针疗法对脑出血的神经保护作用，为本研究的不足之处。