天麻舒心方通过神经内分泌通路干预自发性高血压大鼠心脏舒张功能的机制研究

潘立敏，徐贵成，刘 坤，王 卉，单雅蒙，王 洋

全球疾病负担研究报告显示，心血管疾病仍是最主要的死因[1]。高血压不仅是一种以动脉血压升高为主要表现的疾病，而且是心脑血管疾病的重要危险因素。而左心室肥厚是其最常见的心脏损害，早期主要表现为舒张功能不全，可逐渐发展至舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭，甚至全心衰竭。天麻舒心方具有平肝益肾、滋阴潜阳、活血通络之功效，具有明确的降压作用，且对自发性高血压大鼠(SHR)左室舒张功能损伤具有保护作用，同时可改善高血压心肌超微结构损伤[2-10]。本研究拟通过实验研究，探寻天麻舒心方改善SHR受损的左心室舒张功能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SHR 50只，Wistar雄性大鼠10只，鼠龄14周；动物级别：二级，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001，购置后于中国中医科学院广安门医院动物中心饲养，该中心环境设施符合二级动物(清洁动CL)标准。动物室内温度18～22 ℃；湿度50%～60%；光照和通风条件均符合规定标准。

1.2 实验药物 天麻舒心浸膏液，中国中医科学院广安门医院制剂室生产；氯沙坦钾片，杭州默沙东制药有限公司生产，批准文号：H20030654，研磨后用无菌蒸馏水配制成混悬液。

1.3 实验仪器 动物无创血压测量系统(成都泰盟科技有限公司生产，型号：BP-6)，125I试剂盒(北京华英生物技术研究所)，r-911 全自动放免计数仪(中国科技大学实业总公司提供，检测单位：北京华英生物技术研究所)，聚合酶链式反应(PCR) 仪(Long Gene MyGene MG96+)，荧光定量 PCR 仪(Line-Gene K)，凝胶成像系统(GelOcumentuteon Systern Beosens SC 805)，低温冷冻离心机(Thermo Fresco21)，酶标仪(Thermo Multiskan MK3)，电泳槽(Cavoy Mini P-4)，湿转电泳槽(Tanon VE186)，电泳仪(北京六一 DYY-7C)。

1.4 实验方法 50只SHR按体质量、血压水平分层后随机分为5组，其中天麻舒心方高、中、低剂量组分别给予天麻舒心浸膏液每天11.592 g/kg、5.796 g/kg、2.898 g/kg，分别相当于成人用生药量的28倍、14倍、7倍；西药对照组给予氯沙坦钾混悬液每天17.5 mg/kg；模型对照组给予同体积蒸馏水。10只Wistar大鼠作为正常对照组，给予同体积蒸馏水。各组灌胃给药，每日1次，共18周。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 SHR血浆及心肌血管紧张素(Ang)Ⅱ、Ang(1-7)含量 给药18周后，麻醉，腹主动脉采血5 mL，迅速注入冰水浴冷却的酶抑制剂抗凝管中，摇匀，即刻放回冰水浴中冷却，1 000 r/min离心5 min，分离血浆。处死大鼠后开胸，速取心脏，生理盐水洗净，滤纸吸干，沿房室沟剪掉两心房，剪掉主动脉、肺动脉，紧贴室间隔右侧剪掉右心室游离壁，剩余为左心室，取心室肌并匀浆。125I放射免疫分析法测定血浆及心肌组织的AngⅡ及Ang(1-7)水平。

1.5.2 SHR心肌血管紧张素转换酶(ACE)、ACE2及Ang(1-7)受体(Mas)的mRNA表达 取材方法如前，取-80 ℃冰箱保存的大鼠心肌组织100 mg，Trizol一步法提取心肌组织总RNA，比色法测定总RNA浓度和纯度。逆转录反应后进行PCR扩增。凝胶成像系统检测各组mRNA表达强度。各基因PCR扩增引物序列详见表1。

表1 PCR引物序列

1.5.3 SHR心肌ACE、ACE2及pERK1/2蛋白表达 如取心肌组织，提取蛋白，用蛋白定量(BCA)法测蛋白浓度，经聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶电泳后，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封闭液封闭。用5%BSA-TBST稀释一抗，室温孵育1 h，4 ℃过夜，洗膜，二抗孵育。ECL加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光10 s至5 min(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2 min，定影。凝胶图像分析系统照相和条带密度扫描，按相对系数=目的带表达强度/β-actin表达强度，计算目的蛋白表达相对水平。

2 结 果

2.1 各组血浆及心肌AngⅡ、Ang(1-7)含量比较 与正常对照组比较，模型对照组血浆AngⅡ水平、心肌AngⅡ水平增高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组比较，西药对照组、天麻舒心方高剂量组、天麻舒心方中剂量组、天麻舒心方低剂量组血浆AngⅡ水平差异均无统计学意义(P>0.05)，天麻舒心方低剂量组心肌AngⅡ水平明显降低(P<0.01)。与正常对照组比较，模型对照组血浆及心肌Ang(1-7)均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型对照组比较，天麻舒心方高剂量组、天麻舒心方中剂量组血浆Ang(1-7)含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，西药对照组、天麻舒心方高剂量组、天麻舒心方中剂量组、天麻舒心方低剂量组心肌Ang(1-7)含量明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表2、表3。

表2 各组血浆、心肌AngⅡ含量比较(±s)

表3 各组血浆、心肌Ang(1-7)含量比较(±s)

2.2 各组心肌ACE、ACE2及Mas的mRNA表达比较 与正常对照组比较，模型对照组ACE mRNA表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，ACE2 mRNA、Mas mRNA均明显降低(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较，天麻舒心方中剂量组、低剂量组ACE mRNA水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，西药对照组、天麻舒心方高剂量组、天麻舒心方中剂量组ACE2 mRNA表达明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。西药对照组与天麻舒心方高剂量组Mas mRNA表达较模型对照组有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。详见表4。

表4 各组心肌ACE、ACE2及Mas的mRNA表达比较(±s)

2.3 各组SHR心肌ACE、ACE2及pERK1/2蛋白表达比较 与正常对照组比较，模型对照组ACE蛋白表达、pERK1/2蛋白表达明显增加，ACE2蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较，西药对照组、天麻舒心方高剂量组、天麻舒心方中剂量组、天麻舒心方低剂量组ACE蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)；天麻舒心方中剂量组ACE2蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。西药对照组、天麻舒心方高剂量组、天麻舒心方中剂量组、天麻舒心方低剂量组pERK1/2蛋白表达较模型对照组明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表5、图1。

表5 各组心肌ACE、ACE2及pERK1/2蛋白表达比较(±s)

图1 各组心肌组织ACE、ACE2、pERK1/2蛋白表达条带图

3 讨 论

天麻舒心方由天麻、水蛭、赤芍、牛膝等药物组成，具有平肝益肾、滋阴潜阳、活血通络之功效，适用于高血压阴虚阳亢、血瘀络阻证者。早期的动物实验显示，天麻舒心方具有明确的降压作用，可逆转二肾一夹型高血压大鼠及SHR左室肥厚，降低AngⅡ，初步认为其作用与肾素-血管紧张素-醛固酮系统的抑制有关[2-8]。临床观察发现，服用天麻舒心方4～6个月，血压平均降低9/7 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，并对血浆肾素、AngⅠ、AngⅡ、醛固酮、内皮素等具有不同程度的改善[4]。研究发现，天麻舒心方对SHR的颈动脉重构及阻力血管的富营养重塑具有干预作用[5-8]。新近的实验研究结果提示，SHR模型对照组左室舒张末压(LVEDP)明显上升(P<0.01)，左室压力最大下降速度(-dp/dtmax)绝对值明显下降(P<0.01)，应用天麻舒心方干预18周后，各剂量组LVEDP下降，-dp/dtmax绝对值上升，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；同时发现模型大鼠心肌超微结构受损，表现为心肌肌丝多处断裂、溶解，排列扭曲，粗细不等，线粒体肿胀、变形、聚集，嵴模糊排列混乱，西药组及天麻舒心方各剂量组对大鼠心肌超微结构均有不同程度的改善作用[9-10]。

肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)是神经-内分泌调节机制中的重要组成部分。研究证实，RAS存在两条相互拮抗的通路，即ACE-AngⅡ-AT1受体通路(Angiotensin converting enzyme-AngiotensinⅡ AT1)和ACE2-Ang(1-7)-Mas受体通路[Angiotensin converting enzyme 2-Angiotensin(1-7)-Mas]。前者主要通过AngⅡ引起血管收缩、血压升高、促进心肌细胞和血管平滑肌细胞增生等效应，后者则通过对前者的拮抗，达到保护心血管的作用。ACE2作为ACE的同源物，其主要生物学效应是在内皮细胞中降解AngⅡ，产生Ang(1-7)[11-13]。Ang(1-7)是RAS中重要的活性七肽，与特异性受体Mas相结合，一方面通过拮抗 AngⅡ诱导的血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1)的表达，以减少核转录因子-κB(NF-κB)的核转位，减少单核细胞黏附于血管内皮细胞，并迁入内皮摄取脂质转化为泡沫细胞，从而达到抗细胞增殖的作用；另一方面，通过活化 Mas-PI3K-NOS 信号转导通路，使一氧化氮(NO)生成明显增加，发挥扩张血管的作用[14-15]。由此可见，ACE2作为RAS的内源性调节酶，在调节RAS两轴间的平衡方面发挥着关键作用。ACE-AngⅡ-AT1两轴系统的平衡主要集中于Ang(1-7)与AngⅡ的浓度平衡上，维持AngⅡ和Ang(1-7)之间的平衡是控制血压的关键[16]。

本研究结果显示，SHR整体及心肌局部的Ang(1-7)水平均明显降低，提示Ang(1-7)降低可能是SHR血压升高、左心室肥厚及舒张功能损伤的病理机制之一。经药物干预后，整体及局部的Ang(1-7)水平增高，提示天麻舒心方可能通过增加整体及心肌Ang(1-7)表达而发挥其降低血压、改善高血压心室肥厚及降低高血压左心室舒张功能损伤的作用。同时本研究还发现，模型组SHR心肌组织ACE mRNA表达明显升高，而ACE2、Mas mRNA表达明显降低，提示ACE合成增多、ACE2及Mas合成减少可能是高血压左心室舒张功能损伤的病理机制之一，而前两者的病理改变进一步提示高血压心肌损伤时存在ACE-AngⅡ-AT1和ACE2-Ang(1-7)-Mas受体通路的失衡。中药可以逆转ACE、ACE2比例失衡，但对Mas受体作用有限，提示中药可能在血管紧张素转化酶层面改善高血压心肌损害，从而进一步减轻其功能及形态损伤。

丝裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶(MAPK/ERK)信号转导通路是广泛存在于真核细胞内的一条重要信号转导通路，其中，ERK1/2是细胞信号中传递丝裂原信号的关键激酶，与细胞增殖、分化密切相关，pERK1/2是其磷酸化形式。AngⅡ能磷酸化ERK1/2下调过氧化氢酶(CAT)并促进外膜成纤维细胞α-actin的升高，表达外膜成纤维细胞在向肌成纤维细胞转化，进而促进血管重塑的发生。 MAPK信号传导途径促进NF-κB的产生，可激发其他炎症细胞因子，触发心肌组织内的额外损伤[17]。ERK信号通路参与调节多种生物过程，例如各种细胞的存活、生长和死亡以及炎症相关的免疫反应[18]。另一个MAPK下游转录因子NF-κB会被磷酸化并随后增加核转运，从而促进众多促炎基因的转录，从而引发心肌损伤和功能障碍[19]。

本研究发现，模型对照组pERK1/2的蛋白表达明显增加，说明SHR可能存在ERK1/2信号转导通路激活，从而进一步导致其心肌细胞增殖以致心室肥厚、舒张功能损伤等病理改变，各给药组pERK1/2的蛋白表达均有所降低，提示药物可能通过抑制ERK1/2信号转导通路激活，改善高血压心肌损伤。结果还显示，SHR心肌组织的ACE蛋白表达增加、ACE2蛋白表达降低，结果与相应mRNA表达一致，提示ACE合成增多、ACE2合成减少可能是高血压心脏损害，以致左心室舒张功能损伤的病理机制之一，天麻舒心方各剂量组ACE、ACE2蛋白表达水平变化趋势与相应mRNA表达基本一致，提示天麻舒心方可能在血管紧张素转化酶层面改善高血压心脏损害，从而进一步减轻其功能及形态损伤。

综上所述，高血压早期心脏损害表现为左心室舒张功能下降、心肌超微结构损伤及胶原含量的增加，其机制除血压升高外，可能与ACE-AngⅡ通路激活，ACE2-Ang(1-7)-Mas通路抑制及其下游ERK1/2信号转导通路激活有关，天麻舒心方可能通过调节整体及心肌局部的ACE2-Ang(1-7)通路及其下游ERK1/2信号转导通路的活性，改善高血压心肌超微机制损伤，延缓左心室舒张功能损伤。