凤尾草薄层色谱分离及抗菌活性初步研究

邹志萱，曾亚丹，韦清慧，包梦莹，黄媛媛，王亚丽，张兴艺，王小莺

（江西农业大学/江西农业大学兽药研究所，江西 南昌 330045）

凤尾草是凤尾蕨科凤尾蕨属植物，主要以其叶形和生态环境来命名，如金鸡尾、鸡脚草、井栏边草等，喜生长在荫蔽、湿润、温暖处，也耐旱。在南方冬季，石缝中生长的植株经历一二月份的干旱，不致完全枯死。以全草入药，性凉，味微苦，归肝、肾、大肠经，具有清热利湿、凉血止血、消肿解毒等功效，用于治疗痢疾、肠炎、黄疸型肝炎、吐血、便血、尿血等病症[1]。

虽然大多数不同产地的凤尾草的成分类别可能相同，但是化合物含量不同，所以不同产地凤尾草的质量不同，临床疗效也有差异。为提高凤尾草的质量控制水平，建立和完善相关质量标准，本项目通过研究不同来源的凤尾草药材的薄层色谱法和抑菌圈试验，初步建立一种能够快速鉴定优质凤尾草的薄层色谱指纹图谱，也可为日后合理开发该资源提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 供试药材

人工种植凤尾草为南昌市经开区昌盛大药房购买；野生凤尾草分别于11月、12月采自江西省南昌市梅岭风景区。

1.2 菌种

肠杆菌菌株为江西农业大学动物科学技术学院实验室保存。

1.3 主要试剂

三氯甲烷、石油醚、正己烷、乙酸乙酯、甲酸、乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇、硫酸溶液，所有均为市售一般化学纯试剂，购买于国药集团化学试剂有限公司。改良碘化铋钾、香草醛、磷钼酸、营养肉汤培养基、麦康凯培养基琼脂粉末、薄层硅胶板，由青岛海洋化工有限公司生产。

1.4 主要仪器

中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司生产），立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂生产），恒温培养摇床（上海苏坤实业有限公司生产），双人单面净化工作台(SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司生产），生化培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司生产)；电子天平(ESJ220-4G，沈阳龙腾电子有限公司生产)，恒温培养摇床(SKY-1102C，上海苏坤实业有限公司生产)。

2 方法

2.1 凤尾草乙醇提取物的制备

取供试材料，去杂清洗干净，干燥粉碎。称取凤尾草粉末10 g，与乙醇溶液1∶5的料液比，浸泡30分钟后，于50℃温度加热回流提取1小时，放冷、过滤、滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶散，用20 mL乙酸乙酯振摇提取，水浴蒸干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液，置冰箱4℃冷藏保存[2]。

2.2 凤尾草薄层色谱法建立

2.2.1展开剂的筛选

为了得到理想的分离效果，试验中选择乙酸乙酯-甲酸-水（13∶3∶1），乙酸乙酯-乙醇-水（5∶5∶2），三氯甲烷-乙醇-水（13∶6∶2）等展开系统。

取薄层色谱硅胶G干燥后备用，用微量定样点样器点样于薄层板上，将薄层板放入展开剂饱和后的层析缸中，密封室盖，展开完毕后，取出薄层板，晾干，后置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.2.2显色剂的筛选

取出薄层板后晾干，除一片放置于紫外仪365 nm下直接显色外，其他分别喷以改良碘化铋钾溶液、5%香草醛硫酸溶液、10%磷钼酸乙醇溶液，于干燥箱中110℃干燥5分钟后取出，观察斑点显色情况。

2.3 抗菌活性测定

2.3.1菌液的制备

取-80℃冷冻保存的大肠杆菌冻存管，将其吸入LB液

体培养基中培养，放置于37℃摇床6小时进行快速复苏，紫外分光光度计测定细菌数量，备用。

2.3.2体外抑菌实验

吸取已复壮好的菌液100 μL于麦康凯琼脂培养基[4]上，用三角涂布棒涂开，琼脂打孔法打孔，吸取30 μL培养基封底，防止药液从底部漏出，往平板中分别加入三种不同来源的凤尾草药液，并加入溶剂乙醇作为对照，置于37℃恒温培养12小时，观察测量抑菌圈。

3 结果与分析

3.1 凤尾草薄层色谱法建立

经过对不同展开系统薄层色谱分离效果的比较，结果表明采用展开剂为正己烷∶乙酸乙酯∶甲酸=5∶1∶1，以磷钼酸乙醇溶液为显色剂时，斑点清晰，分离效果最好，而通过365 nm紫外仪观察最为简便直观（图1）。

图1 凤尾草的TLC

3.2 不同来源凤尾草乙醇提取物对大肠杆菌的体外抑菌效果

试验结果见表2。由表2可知，11月、12月的野生凤尾草平均抑菌圈直径分别为29 mm、21 mm，但人工种植凤尾草乙醇提取物产生的抑菌圈较小，为16 mm。而对照溶剂没有抑菌圈（表2）。

表2 不同来源凤尾草提取液对大肠杆菌的抑菌效果

根据所得到的图1、表1、表2结合分析可知，处在同一位置的斑点，表明对应条带的迁移速率在相同实验条件下可以判断其为同一个物质。与人工种植凤尾草斑点相比较，采摘的野生凤尾草提取物的斑点有显著不同，野生凤尾草在斑点1、斑点2、斑点3明显高于人工采摘凤尾草，而野生凤尾草其他部位的斑点比人工种植凤尾草相应部位的斑点弱，由此可推测凤尾草抗菌活性部位为斑点1、斑点2、斑点3，Rf值分别为0.338、0.394、0.451。

表1 凤尾草主要抗菌物质的Rf值

4 讨论

从实验中所得：5%香草醛硫酸溶液在高温情况下能够使展开成分显浅绿色，10%磷钼酸乙醇溶液能够使展开成分显蓝色，改良碘化铋钾能够使展开成分显橘红色，对比各类凤尾草展开后的条带情况以及不同凤尾草醇提液的抑菌效果后，推测凤尾草中起主要抗菌作用的成分是图1中的斑点1、斑点2、斑点3，根据所选的显色剂及文献分析推荐为萜类成分[4]。

凤尾草资源丰富，用途广泛，使用历史悠久。但由于凤尾草成分复杂，因而其分离、鉴定难度极大。因此，开始凤尾草药材的研究时，应对中药的提取条件、方法、有效组分分离等作充分考虑，设置对照组和重复组，以保证试验结果的准确性和真实性。对于日渐增大的市场需求量，现如今凤尾草的开发与利用将是大势所趋，所以建立快速筛查优质凤尾草的方法具有重要意义。