UPLC 同时测定丹参药材中丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的含量分析

曹 莉

（镇江市第一人民医院药剂科 江苏 镇江 212000）

药材丹参的主要药效成分为丹酚酸B（salvianolic acid B, SLB）和丹参酮ⅡA（tanshinone IIA, TNA）[1]。许多研究表明SLB 和TNA 可以改良心脏灌注功能，优化自由基侵蚀情况，这两种物质可以在一定程度上反应丹参药材的药效情况。在药典中，通过对SLB 和TNA 的含量情况进行控制来反映药材丹参的质量程度。先前有研究使用HPLC 法检测这两种成分的含量，但由于此法较为耗时，当面临较多检测量时无法满足测定要求。不同于传统的HPLC 法，超高效液相色谱法（UPLC）具有较高的分离度和更快的分析速度。UPLC 法检测药材丹参含量相比于HPLC 法具有更大优势。

丹参，是一种广泛使用的中药，用于治疗冠心病、脑血管病、肝硬化和细菌感染。丹参是大量活性天然化合物的重要来源，这些活性天然化合物主要分为水溶性和脂溶性（二萜）组分。SLB 是丹参的主要水溶性提取物之一，TNA 是活性最高的二萜醌类色素[2]。两者都因其广泛的药理活性而被广泛研究。

1.仪器与试药

采用Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC 系统，UltiMate 3000 泵，UHPLC 自动进样器，Vanquish ™柱温箱，光电二极管阵列（PDA）检测器以及Standard Instrument Integration（SII）管理软件。SLB 和TNA 标准对照品来自于上海中药标准化中心，纯度＞99%。药材丹参由安徽中医药大学陈亮鉴定为Salvia miltiorrhiza。

2.方法与结果

2.1 色谱条件

Accucore ™ Vanquish ™ C18+超高效液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）流动相为Acetonitrile-0.1%Formic acid 水溶液，梯度洗脱，流速0.6 mL 每分钟；检测波长为280 纳米，柱温30 度。按照此条件对药材丹参进行分离（R ＞2），对称性佳（0.99 ～1.01）。

2.2 对照品溶液的制备

按照千分之一的准确度称取标准对照品SLB 和TNA一定量，导入10 mL 容量瓶中，再导入浓度为75%的甲醇水溶液，震荡溶解，再添加75%甲醇至容量瓶刻度线可得标准对照品溶液。

2.3 样品溶液配制

按照千分之一的准确度称取药材丹参300 mg 倒入20 mL 试管中，震荡溶解，称重后补重。离心后取上清液再用甲醇稀释。再度离心取上清液倒入容量瓶可得样品溶液。

2.4 线性关系考察

按照千分之一的准确度称取标准对照品一定量，采用75%甲醇进行稀释，得到：SLB 溶液7.59，13.39，15.25，379，759 μg/mL；TNA 溶 液1.20，2.37，6.01，60.1，120 μg/mL 的标准对照品溶液。通过分开进样3 μL，共三次进样。按照质量浓度为X 轴，色谱峰面积为Y 轴，通过软件计算回归方程。SLB：Y = 11.89X+1.59，R = 0.9998；TNA：11.78X+4.97，R = 0.9997。 从 色 谱结果可以得出SLB 在7.59 ～759 μg/mL,TNA 在1.20 ～120 μg/mL 线性相关度良好。

2.5 精密度实验

按照千分之一的准确度抽取标准对照品SLB 和TNA的混合溶液。反复进样9 次，色谱结果表明SLB 和TNA的峰面积的相对标准偏差为0.09%和0.08%，精密度较好。

2.6 稳定性实验

按照千分之一的准确度抽取样品溶液3 μL，在一天内反复进样12 次，评价药材丹参的稳定性情况。结果显示SLB 和TNA 的峰面积相对标准偏差低于0.3%，样品溶液在一天内较为稳定。

2.7 重复性实验

按照千分之一的准确度称量300 mg 丹参药材6 份，配制为样品溶液，再行检测。使用方程计算，结果显示相对标准偏差为0.11%。表明本法有较好重复性。

2.8 加样回收实验

按照千分之一的准确度称量丹参药材150 mg，再加入SLB 和TNA 标准对照品一定量，并按照上述方案进行处理，在完成色谱分析后发现，测定均值和相对标准偏差为100.09%，0.43%；100.05%，0.79%。

2.9 样品检测

使用上述方案配制样品溶液，并在上述各种条件下开展测定工作。记录结果后使用方程计算SLB 和TNA 的含量情况，见表1。

表1 样品中SLB 与TNA 的含量情况（mg/g）

3.讨论

3.1 UPLC 与HPLC 的差异

高效液相色谱或高压液相色谱是最流行、最现代、最强大和最通用的色谱分离技术之一，通常用于从复杂混合物（如草药提取物或产品）中分离、鉴定和定量成分，并获得粗混合物的化学图谱或指纹图谱。高效液相色谱可以说是定性和定量测定天然产品提取物、馏分或成品中化合物的最广泛使用的分析分离技术。UPLC 是一种先进的液相色谱技术，具有分析时间短、流动相溶剂用量少的特点[3]。它还能提供更高的分离效率和分析物混合物的分辨率。UPLC 和HPLC 本质上是相同的技术，不应混淆为不同的技术。UPLC 仪器的主要特征是亚2 μm 的颗粒，而不是传统的HPLC 系统中的2.5 ～10 μm 的颗粒。较小的颗粒（＜2 μm）需要更高的压力才能工作，因此，UPLC必须能够达到6 000 psi以上，这通常是HPLC的上限。

在UPLC 中，由于样品粒径较小（＜2 μm），样品与固定相之间的扩散路径较短，效率较高。最近引入的固体核心颗粒被包裹在小颗粒的表面，提供了更小的扩散路径和更高的效率。UPLC 使植物化学家能够比以前更快地解决与从各种基质中分离、检测和定量各种次生代谢物相关的分析挑战。在UPLC 中，运行时间可分别比使用3 和5 μm 色谱柱的HPLC 系统缩短3 倍和9 倍。UPLC 系统由于提高了信噪比，能够在非常低的浓度下检测分析物，并且需要的进样量要小得多，而不会损失任何灵敏度。由于UPLC 与传统的HPLC 不同的明显优势，UPLC 现在已经成为化学、生物医学和药物分析以及各种基质中植物化学物质分析的常规技术。

3.2 丹参的药理学活性

丹参具有活血止痛的功效。其通过使用额外的机制，如抑制凋亡、抑制血小板脱颗粒、抑制肥大细胞脱颗粒、下调白细胞黏附分子的表达和抑制多种细胞因子如肿瘤坏死因子α（TNF-a）和白细胞介素等，丹参研究在预防缺血-再灌注相关的微循环障碍方面具有巨大的意义。研究表明，其主要活性成分TNA 能明显减少脑缺血再灌注后炎症介质的释放，增强超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，从而减轻脑水肿症状，有效减轻大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤[4]。SOD 活性的水平间接反映了身体缓解自由基侵蚀的能力，而丙二醛的水平间接反映了机体的受创程度。研究显示，TNA 能减轻大鼠的神经功能缺损症状，且随着剂量的增加，神经功能缺损的减轻效果更加明显。并且TNA 能降低大鼠脑梗死体积和脑含水量，不同浓度的TNA 能降低缺血再灌注组缺血半球额叶和顶叶皮质超氧化物歧化酶含量，增加丙二醛含量。研究表明，丹参客观上对大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用。

丹参提取物增加内皮型一氧化氮合酶表达的作用在缺氧性肺动脉高压中起重要作用，而增加内皮型一氧化氮合酶表达和磷酸化，诱导血管舒张和血压降低。研究证明SLB 和TNA 显著刺激了由钠离子非依赖性系统y+载体介导的左旋精氨酸的摄取，这表明精氨酸通过质膜的转运并没有通过与钠离子梯度的耦合而被激发。另有研究发现通过AMPK 途径的一氧化氮合酶磷酸化外，SLB和TNA 还通过增加过氧化氢酶的表达来刺激左旋精氨酸的摄取。丹参可能在未来心肌缺血的治疗中发挥关键作用[5]。然而，需要进一步研究丹参介导的一氧化氮产生的机制和观察到的心脏保护作用。