中国优秀柔道运动员爆发力敏感基因位点的确定

亓 朔，苏 浩，许奎元，赵林林，王传军，曹建民

柔道项目是一个运动强度极大的非周期过程，具有竞争性与高强度间歇性，需要较高的绝对和相对水平的肌肉力量，要求运动员在4～5 min内多次发动进攻，瞬间完成复杂的技术动作（Franchini et al.，2011）。选材是支撑竞技体育国际竞争力的九大支柱之一，也是决定一个国家竞技运动水平优劣不可或缺的重要因素（黎涌明等，2018）。我国柔道项目的选材经历过3个阶段，自然选材、经验选材、科学选材，目前以科学选材为主，主要是结合形态学、身体素质、生理生化、心理等指标进行选材（何钢等，2015）。

近年，随着分子遗传学和基因检测技术的不断发展，通过基因技术对优秀运动员进行基因位点筛选，从而为早期运动员的培养提高精准性，提高运动员成才率。

通过在 Pubmed、Web of Science、SPORTDiscus、Med‐line等外文网站搜索“judo”“gene”“explosive force”等关键词确定与爆发力相关的位点作为候选基因位点，位点选择依据：所选项目特点与柔道项目类似且在国内外研究结果为正相关。一项文献检索（1997－2015年）显示，至少有120个遗传标记与优秀运动员状态相关，其中包括77个与耐力相关的遗传标记和43个与爆发力相关的遗传标记，值得注意的是，在43个与爆发力相关的遗传标记中，ACE基因rs4646994位点、ACTN3基因rs1815739位点和PPARα基因rs4253778位点在3项或3项以上的研究中被证明与优秀运动员的爆发力显著相关（Ahmetov et al.，2015）。因此，以上3个位点可纳入本研究的候选基因位点。杨若愚（2017）在对我国优秀运动员爆发力相关基因多态性及其预测模型的研究中发现，ACTN3基因rs1815739、ADBR3基因rs4994、CNTFR基因rs3808871和VDR基因rs7975232位点被证明与中国优秀运动员爆发力存在相关。因此，将ADBR3基因rs4994、CNTFR基因rs3808871和VDR基因rs7975232位点纳入本研究的候选基因位点。国外文献在对CNTFR基因与VDR基因中常选取多个位点进行研究，且结果不一，为保证结果的准确性，将CNTFR基因rs41274853与VDR基因rs2228570位点纳入本研究的候选基因位点（Bahat et al.，2010；Bjork et al.，2019；Hong et al.，2014；Massidda et al.，2015；Miyamo‐to-Mikami et al.，2016）。

综上，本研究选用如下候选基因位点：ACTN3基因rs1815739位点、ADBR3基因rs4994位点、CNTFR基因rs3808871和rs41274853位点、PPARα基因rs4253778位点、VDR基因rs7975232和rs2228570位点及ACE基因rs1799752位点。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

研究对象分为两组：优秀柔道运动员组与普通组，将54名汉族优秀柔道运动员组成的优秀柔道运动员组命名为J组（165.6±3.7 cm，22.±3.4岁，训练年限9.63±3.30年），180名汉族普通大学生组成的普通组命名为C组（166.8±4.5 cm，20.4±2.5岁）。J组从国家队以及地方省队选取，要求运动员等级为国家健将或国际健将，民族为汉族，C组从北京体育大学本科生中随机招募，要求无任何专业队运动训练经历，民族为汉族。

1.2 DNA样本的采集

本实验方案通过北京体育大学道德伦理审查专家委员会的审查（审批编号：2019020H）。受试者的采样均为无创的唾液采集，在采样前受试者阅读并填写知情同意书。

取口腔脱落细胞：取样前用清水漱口，为了避免样本不被污染，漱口后勿进食饮料和零食等，漱口后30 min由测试人员拿口腔拭子取样，在口腔左右内壁涂抹10次，取样时要注意力度稍大，取样后置于4℃保存。

1.3 DNA的提取

取样后按照口腔试剂盒中的提取步骤进行提取。

1.4 基因分型

采用SNaPshot技术对样本进行SNP分型。通过反应，引物延伸一个碱基即终止，再经测序仪检测，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知插入的碱基种类，从而确定该样本的基因型（图1）。

图1 SNapshot原理Figure 1. SNapshot Principle

1.4.1 PCR引物设计合成

表1 各基因位点引物名称与引物序列Table 1 Primer Name and Primer Sequence for Each Gene Locus

依据NCBI网站公布的基因序列，用Primer 5.0软件设计PCR引物。

1.4.2 扩增反应、延伸反应及纯化

扩增反应、延伸反应及纯化等步骤参考3730XL仪器操作指南进行。

1.4.3 基因分型结果

每个位点对应的位置上如果出现单一的一个较长的波峰，说明这个基因位点的基因型为纯合型，如果出现两个连续较短的波峰，说明这个基因位点的基因型为杂合型（图2）。

图2 某一样本SNP基因分型结果Figure 2. Results of SNPGenotyping of a Sample

1.5 数理统计

每组的基因分型结果均进行Hardy-Weinberg平衡检验，当P＞0.05时，说明基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明研究对象具有群体代表性。每组的基因型与等位基因分布数据均采用卡方检验，将P＜0.05定义为两组的基因型分布与等位基因分布差异具有统计学意义。

2 研究结果

2.1 各位点基因分型结果的Hardy-Weinberg平衡检验结果

54名优秀柔道运动员与180名普通大学生各基因位点经Hardy-Weinberg平衡检验符合Hardy-Weinberg平衡定律（表2），表明研究对象具有群体代表性（P＞0.05）。

表2 两组各位点基因分型结果的Hardy-Weinberg平衡检验结果Table 2 Genotyping Results of Each Locus in Two Groups Test‐ed by Hardy-Weinberg Equilibrium Test

2.2 各位点基因型分布结果和等位基因分布结果

ACTN3基因rs1815739位点中J组CC基因型频率显著高于对照组（P＜0.05；表3），C等位基因频率显著高于对照组（P＜0.05）；CNTFR基因rs41274853位点中J组GG基因型频率显著高于对照组（P＜0.05），G等位基因频率显著高于对照组（P＜0.05）。其余基因位点中基因型频率与等位基因频率在J组和C组间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 两组间各位点基因型分布结果和等位基因分布结果的统计显著性

ACTN3基因rs1815739位点基因型分布与等位基因分布在优秀柔道运动员和普通人之间的差异具有统计学意义（P＜0.01；表4）；CNTFR基因rs41274853位点基因型分布与等位基因分布在优秀柔道运动员和普通人之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 分析与讨论

3.1 ACTN3基因rs1815739位点与爆发力的关系

本研究发现，优秀运动员（健将级及以上）的ACTN3基因rs1815739位点基因型分布、等位基因分布与C组相比差异具有统计学意义（P＜0.01；表4），J组中CC基因型频率显著高于C组，且CC基因型在优秀运动员中的分布频率高于CT、TT基因型频率（表3），表明该基因多态性位点与优秀柔道运动员存在关联。

表3 两组各位点基因型分布结果和等位基因分布结果Table 3 Results of Genotype Distribution andAllele Distribution of Each Locus in Two Groups

表4 两组间（J vs.C）各位点基因型分布与等位基因分布结果的统计显著性Table 4 Statistical Significance of Results of Genotype Distribution andAllele Distribution of Each Locus between Two Groups（J vs.C）

Rodriguez-Romo等（2013）研究该位点时未发现西班牙精英男性柔道运动员与普通人之间存在差异，得出ACTN3基因rs1815739多态性与优秀柔道运动员竞技状态不显著相关。同样是以优秀柔道运动员为研究对象，可能是因为基因多态性存在地域、人种的差异，从而引起结果不一致。

Kikuchi等（2012）对日本优秀摔跤运动员进行ACTN3基因多态性分析，发现ACTN3基因多态性与日本优秀摔跤运动员的运动状态有关。该研究结果与本研究结果一致，可以看出即便两个研究中的实验对象民族不同，但两个项目的特点类似，均是以高强度对抗的间歇运动，且以爆发力为主的项目。

杨晓琳等（2010）与李燕春等（2016）在研究该位点时发现CC基因型可作为中国北方汉族举重运动员与中、长距离游泳运动员选材的分子标记。杨若愚（2017）在中国优秀运动员爆发力相关基因多态性及其预测模型的研究中发现，ACTN3基因rs1815739位点与我国优秀运动员的爆发力存在相关。由此可见，在以我国优秀运动员为研究对象时，上述研究与本研究结果保持一致，因此，在选择研究对象时，要保证优秀组与普通组的民族、地区来源相一致。鉴于全国范围内柔道项目健将数量较少，本研究在进行两组比较时，保证民族相一致（均为汉族），从而减小误差，提高实验结果的准确性。

结合该位点发展趋势来看，已被研究证明该位点与优秀运动员的爆发力存在关联。有研究表明，ACTN3基因rs1815739位点表现的CC基因型与C等位基因在速度和力量素质中占优势（杨若愚，2017；Ahmetov et al.，2015；Moran et al.，2007；Vincent et al.，2007；Yang et al.，2017）。上述结果的一致性表明，该位点对肌肉的收缩速度、爆发力有一定影响。研究表明，ACTN3基因指导合成的α-辅肌动蛋白-3仅存在于快肌纤维中，α-辅肌动蛋白-3在肌肉快速收缩过程中对其进行保护。动物实验表明，含有α-辅肌动蛋白-3的小鼠模型中无氧代谢酶活性较高（Ma‐carthur et al.，2007；Vincent et al.，2007）。

柔道属于高强度的对抗运动，代谢途径以无氧代谢为主，爆发力直接影响比赛成绩。本研究证明了基因型CC与等位基因C对于柔道项目是优势基因型，因此，在进行运动员选材时可采用该方法辅助运动员选材，从而提高运动员的成才率，为后续基因选材提供理论依据以及数据支持。

3.2 CNTFR基因rs41274853位点与爆发力的关系

本研究发现，优秀运动员（健将级及以上）的CNTFR基因rs41274853位点基因型分布、等位基因分布与C组相比差异具有统计学意义（P＜0.05；表4），J组中GG基因型频率显著高于C组，且GG基因型在优秀运动员中的分布频率高于GA、AA基因型频率（表3），表明该基因多态性位点与优秀柔道运动员存在关联。

Miyamoto等（2016）以日本精英运动员为研究对象时发现，该基因位点多态性与国际短跑力量运动员的力量表型指标显著相关，研究结果与本研究结果保持一致。

本研究结果与杨若愚（2017）等的研究结果不一致。原因如下：1）选择爆发力项目时存在一定偏差，分析中国优秀运动员爆发力相关基因多态性及其预测模型的研究发现，在选择爆发力项目的优秀运动员时涵盖多个项目（田径、标枪、撑竿跳、跳高、跳远等），多样化的爆发力项目可能会造成研究结果的多样性；2）研究对象的选择不够严谨，分析中国优秀运动员爆发力相关基因多态性及其预测模型的研究发现，对于爆发力组的人员选取并未控制研究对象的民族一致性，只是保证了人员所从事的项目均是以爆发力为主的项目，对照组也未保证民族一致；3）优秀组与普通组的人数比例存在一定偏差，分析中国优秀运动员爆发力相关基因多态性及其预测模型的研究发现，优秀组与普通组人数比例约为1∶1，国内外研究在进行SNP位点分析比对时发现，优秀组与普通组的人数比例约为1∶3。因此，本研究在保证爆发力项目独立的基础上，J组与C组的民族保持一致，J组与C组的人数比例大约控制在1∶3。未来，尚需研究进一步证实该位点与爆发力项目优秀运动员之间的关联。

目前，鲜见国内关于该位点与运动能力的研究，以往的研究表明，CNTF作为一种神经营养因子可以营养神经和肌肉，与受体结合后发挥化学传递作用，从而为大多数神经细胞的生长和分化提供营养（Fraysse et al.，2000；Gayagay et al.，1998；Guillet et al.，1999）。柔道项目是一项高强度的对抗运动，肌肉的收缩是在神经的调控下完成的，提高神经系统的兴奋性可以增加运动单位的募集效果，从而动员更多的肌纤维参与肌肉的收缩，提高机体的爆发力。从该基因影响的生理机制来看，未来可能是一个潜在的爆发力基因位点。因此，CNTFR基因可能是改变肌肉的收缩特性来影响肌肉的性能，同时，可能也与肌肉的体积相关，CNTFR基因与运动员状态和肌肉表现关系的分子机制尚不清楚，需要进一步研究证明。值得注意的是，在保证研究对象人数比例合适的情况下，应增加该基因的多个位点进行分析，从而提高实验结果的准确性。

3.3 其他基因位点与爆发力的关系

PPARα是调节脂质、葡萄糖能量平衡，血管炎症的转录因子，以及调节骨骼肌和心肌脂肪酸的氧化，Petr等（2014）发现，C等位基因携带个体与捷克精英男性冰球运动员状态相关。ACE是肾素-血管紧张素系统中的一个关键酶，可以引起心肌细胞肥大，造成运动性心肌肥大，从而影响机体的心血管功能。Papadimitriou等（2016）发现，AA型的短跑运动员能够以更短的时间完成冲刺，认为该型的运动员具有较好的爆发力。VDR主要参与维持钙磷平衡，通过影响基因转录调控相应蛋白的合成。

本研究尚未发现选取的PPARα基因rs4253778位点、ACE基因rs1799752位点、VDR基因rs7975232和rs2228570位点以及ADBR3基因rs4994位点与我国优秀柔道运动员爆发力相关，还需进一步的实验考证。

4 结论

ACTN3基因rs1815739位点、CNTFR基因rs41274853位点可确定为与我国优秀柔道运动员爆发力存在关联的基因位点，日后可作为基因选材的分子标记。