铁皮石斛提取物与红茶提取物联用改善切除卵巢致骨质疏松小鼠骨组织形态的研究*

王明月，孙泽锐，安孟飞，申 畅，胡财江，赵云丽，王宣军，盛 军

(1.云南农业大学，普洱茶学教育部重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明 650201；3.云南大学 化学科学与工程学院，教育部自然资源药物化学重点实验室，云南省天然产物转化与应用重点实验室，云南 昆明 650091；4.云南农业大学 理学院，云南 昆明 650201)

骨头是一种不断被塑造、形成与修复的刚性但有活力的器官，它是构成脊椎动物内骨骼的关键部分[1-2]。绝经后骨质疏松症是一种以骨量减少、骨折风险增加以及骨结构潜在变化为特征，由骨内稳态破坏引起的骨代谢疾病[3-4]。由于妇女绝经后会导致体内雌激素分泌水平降低从而导致骨量减少，因此绝经后的妇女成为骨质疏松症发病率最高的人群[5-7]。目前临床上治疗骨质疏松症的方法主要是采取药物治疗，随着对天然植物高效、低副作用的报道，人们把目光转向了药食两用的植物。

铁皮石斛(Dendrobium candidumWall.ex Lindl.)为兰科石斛属多年附生草本植物，是中国传统的名贵中药材，具有药食同源性[8]。在唐代医学经典《道藏》中被列为“中华九大仙草之首”[9]，同时享有“药中黄金”之美称。铁皮石斛具有抗炎[10]、抗肿瘤[11-12]、提高机体免疫力[13]以及预防肝损伤[14]等多种药理活性，且其中的多糖成分具有抗氧化[15-16]、降血糖[17]以及降血压[18]等功效，药用价值颇高。茶是全球仅次于水的第二大饮料，而中国是茶的故乡也是茶文化的发源地[19]。中国主要将茶叶分为六大类，即青茶(乌龙茶)、白茶、黑茶、绿茶、黄茶和红茶[20]；其中红茶是全球生产和消费最为广泛的一种茶叶[21]。在中国，从古代开始，茶叶就已被用作药物[22]，红茶因含有茶黄素、茶红素、儿茶素和黄酮等活性成分而具有一些独特的功效，使其具有较高的药用价值[23]。前人研究证明：红茶具有预防高血压[24]、降低体质量[19]、降低患卵巢癌[21]、前列腺癌[25]、乳腺癌、肺癌和结肠癌[26]等疾病的风险，同时还能够改善骨质疏松症[27]。也有相关文献报道喝红茶的老年妇女比不喝的人骨密度要高[28]。

有文献报道：单用铁皮石斛提取物[29]和单用红茶提取物[27]均能改善切除卵巢所致大鼠骨质疏松，但未见关于二者联用对骨微结构影响的报道。因此，本研究以铁皮石斛和红茶提取物的联用组方为研究对象，采用Micro-CT 技术研究其对切除卵巢致骨质疏松模型小鼠骨微结构的改善作用。

1 材料与方法

1.1 试验样品

铁皮石斛提取物呈土黄色粉末状，提取率为23.49%，其中多糖含量为32.15%；红茶提取物呈黑褐色粉末状，提取率为25%，其中茶黄素含量为0.57%，以上样品均由云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室提供。铁皮石斛提取物与红茶提取物按质量比5∶2 混合得到所需的试验样品，试验时取适量用双蒸水混悬定容至相应剂量备用。戊酸雌二醇片购自拜耳医药保健有限公司广州分公司，研磨成粉后取适量用双蒸水定容备用。

1.2 骨质疏松症模型小鼠的建立

雌性SPF 级ICR 小鼠，体质量28～30 g，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SYXK(滇)K2013—0004。动物饲养于IVC 动物实验室(S8，苏州苏杭科技有限公司)，温度(24±1)℃，相对湿度为50%～60%，12 h 昼夜交替，自由进食与饮水。小鼠适应环境1 周后，将72 只小鼠按照随机区组法分为假手术组(S 组，未切除卵巢)、模型组(M 组)、雌二醇组(E2组，阳性对照)、铁皮石斛提取物与红茶提取物联用低剂量组(DCE+BTE-L 组)、铁皮石斛提取物与红茶提取物联用中剂量组(DCE+BTE-M 组)和铁皮石斛提取物与红茶提取物联用高剂量组(DCE+BTEH 组)。分组后模型组与处理组均摘除小鼠双侧卵巢，而假手术组仅切除小鼠两侧卵巢周围同质量的脂肪组织。术后小鼠恢复1 周后通过灌胃的方式给予样品，剂量分别为：E2组1.5 mg/kg、DCE+BTE-L 组0.475 g/kg，DCE+BTE-M 组0.950 g/kg，DCE+BTE-H 组1.425 g/kg。连续给药3 个月，每周称小鼠体质量；解剖前禁食10 h，解剖后取小鼠左侧股骨进行Micro-CT 观察。

1.3 影像学检测

Micro-CT (μCT 100，瑞士SCANCO Medical AG 公司)对骨质疏松模型小鼠的左侧股骨进行形态计量学分析。采集参数为：分辨率10 μm，曝光时间300 ms，电压70 kV，电流200 μA。检测小鼠左侧股骨的骨小梁结构、骨密度(BMD值)、骨小梁体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。试验重复3 次。

1.4 统计学分析

试验数据用平均值±标准误(mean±SE)表示，用SPSS 17.0 和Graph Pad Prime 5 处理数据，数据分析采用双尾t-test 分析，P值小于0.05 代表有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛提取物与红茶提取物联用对骨质疏松模型小鼠股骨的骨小梁结构的影响

由图1 可知：与假手术组相比，切除卵巢可致模型小鼠骨小梁结构破坏；用雌二醇和铁皮石斛提取物与红茶提取物联用的低、中和高剂量分别给骨质疏松模型小鼠连续灌胃3 个月后，与模型组相比，雌二醇组小鼠骨小梁结构略有改善，铁皮石斛提取物与红茶提取物联用可明显改善小鼠由于切除卵巢而导致的骨小梁结构损伤的情况，其中以中剂量组效果更佳。

图1 铁皮石斛提取物与红茶提取物联用对去卵巢致骨质疏松模型小鼠骨小梁结构的影响Fig.1 The effect of combination of Dendrobium candidum extract and black tea extract to bone trabecular structure in ovariectomized osteoporosis model mice

2.2 铁皮石斛提取物与红茶提取物联用对骨质疏松模型小鼠股骨的骨密度的影响

由图2 可知：与假手术组相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨密度显著降低(P＜0.05)；与模型组相比，雌二醇组、铁皮石斛提取物与红茶提取物联用低、中和高剂量组均可增加股骨骨密度(分别为P＜0.01、P＞0.05、P＜0.05 和P＜0.01)。

2.3 铁皮石斛提取物与红茶提取物联用对骨质疏松模型小鼠股骨的骨小梁体积比的影响

由图2 可知：与假手术组相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨小梁体积比显著减小(P＜0.05)；与模型组相比，雌二醇组小鼠股骨骨小梁体积比无明显变化，但铁皮石斛提取物与红茶提取物联用低、中和高剂量组小鼠股骨骨小梁体积有增加趋势(P＞0.05)。

2.4 铁皮石斛提取物与红茶提取物联用对骨质疏松模型小鼠股骨的骨小梁厚度的影响

由图2 可知：与假手术组相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨小梁厚度极显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，连续12 周灌胃给予切除卵巢致骨质疏松模型小鼠雌二醇和铁皮石斛提取物与红茶提取物联用物，均可显著或极显著提高小鼠骨小梁厚度(P＜0.05 或P＜0.01)。

2.5 铁皮石斛提取物与红茶提取物联用对骨质疏松模型小鼠股骨的骨小梁分离度的影响

由图2 可知：与假手术组相比，切除卵巢可致模型小鼠股骨骨小梁分离度增加(P＜0.05)；与模型组相比，铁皮石斛提取物与红茶提取物联用低、中和高剂量组小鼠股骨骨小梁分离度有减小的趋势(P＞0.05)，而雌二醇组小鼠股骨骨小梁分离度表现为增加趋势(P＞0.05)。

图2 铁皮石斛提取物与红茶提取物联用对去卵巢致骨质疏松模型小鼠骨组织形态的影响Fig.2 The effect of combination of D.candidum extract and black tea extract to bone morphology in ovariectomized osteoporosis model mice

3 讨论

铁皮石斛是一种药食两用植物[30]，属于石斛属植物中的名贵品种，主要成分包括石斛多糖、氨基酸、菲类化合物、生物碱和微量元素等[31]，具有调节免疫和血糖、抗炎和抗肿瘤[32-35]等多种生理活性。此外，有文献报道：铁皮石斛提取物能够抑制破骨细胞分化，亦能促进成骨细胞增殖[36]。虽然文献报道其具有改善骨质疏松的活性，但因其高昂的成本限制了进一步的产品开发。红茶是全世界广泛接受的饮品，它可以有效保护和修复切除卵巢引起的单核细胞氧化应激状态以及骨量丢失[37]；可以通过增加切除卵巢大鼠体内雌激素水平起到预防骨质疏松的作用[27]，但因其咖啡因含量较高，使得产品研发受限。为克服上述不足，课题组前期研究了铁皮石斛提取物与红茶提取物联用(DCE+BTE)对骨质疏松症大鼠模型的影响，结果发现二者联用对骨质疏松模型大鼠的改善优于单用铁皮石斛和红茶提取物[35]。本研究在此基础上，进一步研究其对骨微结构的影响。

根据《保健食品增加骨密度功能评价方法》指导原则，推荐使用双侧卵巢切除诱导啮齿类动物骨质疏松模型，因为它可以模拟人体绝经后雌激素缺乏引起的骨丢失[38-40]。Micro-CT 是以组织学检测高分辨率与影像学检查无创性为特点的技术，能够清晰地扫描和重建骨小梁立体结构，它不仅能够评估整体的骨量参数，还能够提供骨微结构的形态计量学参数[41]。因此，本研究采用该技术评价DCE+BTE 对切除双侧卵巢所致骨质疏松小鼠骨微结构的变化。结果显示：用DCE+BTE处理后的小鼠骨小梁分布较致密，形态结构和断裂现象较模型组有明显改善；骨密度和骨小梁厚度升高，骨小梁体积分数增加，骨小梁分离度降低。本研究结果为铁皮石斛提取物与红茶提取物联用在骨质疏松症方面的应用提供了试验依据。

人体正常骨稳态是由成骨细胞与破骨细胞之间的平衡来维持[1]，如果这种平衡被打破，即破骨细胞负责的骨吸收增加或者是成骨细胞主导的骨形成不足就会引发骨质疏松症[42]。因此，从抑制破骨细胞分化和/或促进成骨细胞增殖入手研究治疗或预防骨质疏松症的药物或保健品至关重要。本试验所建立的切除小鼠双侧卵巢致绝经后骨质疏松症模型属于破骨细胞增生型，而未对促进成骨细胞增殖的模型进行研究，所以在将来的研究中增加对此类模型的研究可以全面阐释DCE+BTE 改善骨质疏松的作用。此外，本研究采用的是二者的提取物，深入开展其中有效成分的进一步分析将对未来的产品研发提供质量控制标准。本研究明确了DCE+BTE 可以改善骨微结构。已有研究显示：与破骨细胞分化的相关信号通路主要涉及OPG/RANKL/RANK[43-44]、NF-κB[45-48]、c-Src-PI3K-AKT[49-51]以及MAPKs[52-56]等；常见的成骨细胞增殖的相关信号通路有Wnt/β-catenin[57-60]、BMP-Smads[61-63]、Notch[64-66]以 及 Hedgehog[67-68]；而DCE+BTE 中的活性成分是否是通过这些信号通路发挥作用还需通过细胞生物学以及分子生物学试验来进一步研究。

4 结论

连续12 周对切除卵巢小鼠灌胃铁皮石斛提取物(DCE)与红茶提取物(BTE)联用可明显改善骨质疏松小鼠的骨微结构，增加骨密度。该结果为深入开发利用DCE+BTE 提供了试验依据。