不同蛋白酶水解牛肉蛋白产物的ACE抑制活力比较

李希宇，林伟玲，杨怀谷，叶宇游，刘忠义

（1.湘潭大学化工学院，湖南湘潭 411105）（2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加工重点实验室，广东广州 510610）（3.中山市黄圃镇农业服务中心，广东中山 528400）（4.博罗县农业农村综合服务中心，广东惠州 516100）

高血压是目前全世界最常见慢性疾病之一，其主要病例表征为体循环动脉血压增高（收缩压≥140 mm Hg，舒张压≥90 mm Hg），同时也是多种心脑血管疾病的主要诱因[1]。目前，高血压的发病机制尚未明确，但高血压的发生、发展与动脉血压调节因素息息相关[2]。血管紧张素转换酶（angiotension converting enzyme，ACE）是一种具有膜结合、含锌离子的二肽羧肽酶，其升血压机制是：ACE催化血管紧张素Ⅰ转化成血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩，同时使具有血管扩张作用的缓激肽失活，最终导致血压上升[3,4]。因此ACE抑制剂可以通过抑制ACE的活性，减少血管紧张素Ⅱ的生成，起到降低血压的作用。常见的化学合成降压药卡托普利、依那普利和赖诺普利等，它们降压效果显著但同时具有过敏、皮炎、头晕恶心、味觉迟钝等副作用。在众多的ACE抑制剂中，通过酶解制备的天然源ACE抑制肽具有安全性高、毒副作用低、可长期摄入等优势，必将成为未来降压产品开发的研究热点。目前，国内外研究学者已从海参[5]、罗非鱼[6]、玉米[7]、牛奶[8]、向日葵[9]、海藻[10]等中获得具有良好降压效果的ACE抑制肽。

因牛肉营养丰富、肉质鲜美，其氨基酸组成比猪肉更接近人体需求，钙、磷、铁、锌等常量、微量元素含量丰富，还具有低脂肪、低胆固醇等优点[11,12]。本研究选择以牛肉为酶解底物，开发食源性ACE抑制肽。并且对于部分人群，不便于直接食用牛排等难消化的牛肉制品，可以根据特定人群的营养需求开发多肽产品、氨基酸补充剂等新型牛肉制品[13]。牛肉蛋白经酶解加工，大分子量、结构复杂、不利于消化的蛋白质被降解，提高了肉的营养价值、食用口感、消化利用率，进一步酶解后能够获得高经济或具备保健功能的产品[14]。Jang等[15]从牛肉水解物中提取的多肽序列VLAQYK，在口服给药自发性高血压大鼠检测实验中对收缩压有显著降低作用。随着人们对保健食品的兴趣日益增加，将牛肉开发成兼具营养和保健功能的食品辅料，对牛肉高效利用和深度开发，具有重要意义和市场前景。

鉴于以牛肉为原料制备ACE抑制肽研究较少，本研究以牛肉蛋白为原料，通过复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解牛肉，比较不同酶解产物在模拟胃肠道消化前后的ACE抑制活力变化和分子量分布，分析酶解液感官评价，为牛肉蛋白酶解工艺应用于功能性食品的开发、利用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

市售牛肉：广州市天河区西亚兴安超市；复合蛋白酶（Protamex）、风味蛋白酶（Flavorenzyme）：诺维信生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（Papain）：生工生物工程有限公司；菠萝蛋白酶（Bromelain）、中性蛋白酶（Neutrase）、碱性蛋白酶（Alcalase）：源叶生物科技有限公司；牛皮胶原蛋白肽：广州市华恭生物科技有限公司；血管紧张素转换酶（ACE）、N-[3-丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）、胃蛋白酶、胰蛋白酶：美国Sigma公司；十水四硼酸钠（硼砂）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、邻苯二甲醛（OPA）、二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）等分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1800紫外分光光度计，岛津仪器有限公司；SHA-B恒温振荡器，上海力辰邦西仪器科技有限公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪，福斯（FOSS）分析仪器公司；SynergyH1多功能酶标仪，美国Biotek公司；T25高速均质机，德国IKA公司；EPS-300数显式稳压稳流电泳仪，上海Tanon科技有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司；PB-10台式PH计：德国Sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白酶活力的测定

参考文献[16,17]的方法稍作修改。以275 nm波长的吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制0～200 μg/mL酪氨酸溶液的标准曲线。精确称取标准酪蛋白2 g，加入100 mL 0.1 mol/L PBS（pH根据实验条件调整）缓冲溶液，适当加热，搅拌至酪蛋白全部溶解。分别称取蛋白酶样品0.1 g，溶解于10 mL相应pH值缓冲溶液，以缓冲液1:100比例稀释，得1:10000稀释比例酶液。不同蛋白酶在不同pH、温度条件下测定酶活力，正交试验设计如表1。

表1 双因素交叉设计Table 1 Two factor crossover design

酶液样品：1.00 mL酶液与1.00 mL酪蛋白溶液混匀，精确计时10 min后，加入2.00 mL三氯乙酸溶液，混匀静置，8000 g离心10 min后取上清液。空白样品：1.00 mL酶液与2.00 mL三氯乙酸溶液混匀，精确计时10 min后，加入1.00 mL酪蛋白溶液，混匀静置，8000 g离心10 min后取上清液。每个样品做3个平行，于波长275 nm，分别测定其吸光度。从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力A，单位为U/mL。样品的酶活力按下式计算：

式中：

A——由标准曲线所得的样品最终稀释液的酶活力，U/mL；

N——稀释倍数，取10000；

4——反应试剂的总体积，mL；

10——反应时间10 min，以min计。

根据酶活选择不同蛋白酶的最佳酶解条件，对牛肉蛋白进行酶解。

1.3.2 酶解工艺

取10 g牛肉糜，加入40 mL去离子水，于高速均质机中经10000 r/min处理2 min。置于100 mL的锥形瓶中，用3 mol/L HCl或NaOH溶液调整pH值。不同酶在其最佳酶解条件下进行酶解。按照4000 U/g牛肉加入蛋白酶，空白对照加酶量为0，置于用恒温震荡水浴锅酶解，转速120 r/min，水解时间4 h。酶解1 h时，测定酶解液pH值，并将其调整到指定值。100 ℃煮沸4 min终止酶解反应。酶解液冷却后经离心机8000 r/min离心15 min，取上清液4 ℃保存以备分析。

1.3.3 水解度（DH）的测定

OPA法：参考文献[18]的方法稍作修改。用去离子水将酶解液样品稀释100倍，取400 μL加入含有3.0 mL OPA试剂的石英比色皿中，充分混匀，避光反应2 min，测定340 nm波长处的吸光度。计算公式如下：

式中：

h——每克牛肉蛋白被断裂的肽键数，mmol/g；

htot——每克牛肉蛋白质所含的总肽键数，mmol/g。

1.3.4 模拟胃肠道消化

参考文献[19-21]的方法稍作修改。将0.500 g胃蛋白酶溶解于25.0 mL 0.01 mol/L HCl溶液，得到胃蛋白酶原液；将0.100 g胰蛋白酶溶解于去离子水，得到胰蛋白酶原液。胃消化：取酶解液样品20.0 mL，用3 mol/L HCl溶液将pH值调至3.0，加入0.60 mL胃蛋白酶原液，置于37 ℃恒温震荡水浴锅，转速120 r/min，消化时间1 h，用3 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.0终止消化；肠消化：样品中加入0.25 mL胰蛋白酶原液，置于37 ℃恒温震荡水浴锅，转速120 r/min，消化时间1 h，煮沸2 min终止消化。消化液冷却后经离心机8000 r/min离心15 min，4 ℃保存，以备分析。

1.3.5 ACE抑制活性的测定

参考文献[22,23]的方法稍作修改。分析前，用缓冲液（50 mM Tris-HCl，含300 mM NaCl，pH值7.5）将酶解液消化前后的样品分别稀释至1 mg N/mL。在96孔板中，每孔加入10 μL ACE溶液（0.25 units/mL，去离子水）和30 μL样品，在37 ℃孵育5 min后，加入150 μL的FAPGG（0.88 mM，Tris-HCl缓冲液）溶液。空白对照为30 μL的Tris-HCl缓冲液。

在340 nm波长处，监测ACE降解FAPGG引起的吸光度衰减和水解物的抑制性能40 min。ACE活性表示为吸光度在340 nm处下降的斜率，从第10 min到第35 min的线性间隔。在此时间区间内，吸光度信号稳定，无信号漂移迹象。水解物的ACE抑制率(%)计算为：

式中：

ΔA样品——水解液样品的斜率；

ΔA空白——对照样品的斜率。

1.3.6 分子量分布

1.3.6.1 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

牛肉蛋白样品：取10 g牛肉糜，加入60 mL 6 mol/L的尿素溶液充分溶解蛋白，于高速均质机中经10000 r/min处理2 min，离心机8000 r/min离心15 min，取上清液。

用去离子水将酶解液样品和牛肉蛋白样品的蛋白含量稀释至10 mg/mL。分离胶质量分数15%，浓缩胶质量分数5%，电泳后用考马斯亮蓝R-250染色。

1.3.6.2 Tricine-SDS-PAGE超低分子量蛋白凝胶电泳

Tricine-SDS-PAGE参照黄薇等人[24]方法进行。用去离子水将酶解液样品蛋白含量稀释至10 mg/mL。分离胶为20.0%，夹层胶为10.0%，分离胶为4.0%。电泳结束后用考马斯亮蓝G-250染色。

1.3.7 感官评价

感官评价分析在温度为23±2 ℃的感官评价室进行，由8名专业感官评价员（4男4女）组成感官评定小组。感官评价样品由6种酶解液样品和1种牛皮胶原蛋白肽（商品）溶液组成，7种样品随机排序并编号，对其风味、外观特性进行感官评价，对外观、气味、牛肉特征味、鲜味及无苦味5个指标进行感官评价，满分为50分。每个样品在口中保持10～15 s后吐出，并在品尝下一个样品前用清水漱口2次。最后取8人的平均分作为最终结果。评价标准如表2所示。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria

1.3.8 数据分析

采用SPSS Statistics软件进行统计分析和Origin 2019软件进行制图，并进行多组均数相关性分析、方差齐性检验和单因素方差分析和Duncan多重比较；p<0.05为具有显著性差异。数据结果以（平均值±标准差）标示。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的酶活力

六种蛋白酶在不同pH值和温度下酶活力如表3。

表3 双因素方差分析结果Table 3 Results of two-way ANOVA

由表3可见，同一种蛋白酶在不同pH和温度条件下的酶活力差异显著。综合考量实际因素，各酶选择相应的最佳酶解条件：Protamex酶解条件为温度40 ℃，pH 8.0，酶活力为130.26 U/mg；Flavorenzyme酶解条件为温度50 ℃，pH 7.0，酶活力为28.76 U/mg；Papain酶解条件为温度50 ℃，pH 7.0酶活力为832.29 U/mg；Bromelain酶解条件为温度40 ℃，pH 7.0，酶活力为65.74 U/mg；Neutrase酶解条件为温度50 ℃，pH 7.0，酶活力为73.61 U/mg；Alcalase酶解条件为温度60 ℃，pH 9.0，酶活力为491.42 U/mg。

2.2 不同蛋白酶酶解液在消化前后ACE抑制效果

在料液比1:4（g/mL）、酶底物比4000 U/g、酶解时间4 h，各酶在2.1筛选出的pH和温度下酶解，并对酶解产物进行1.3.4模拟胃肠道消化处理，比较Protamex、Flavorenzyme、Papain、Bromelain、Neutrase和Alcalase的牛肉蛋白酶解液（总氮浓度调整为1 mg/mL）在消化前后的ACE抑制活性，如图1所示。

图1 六种蛋白酶解液在消化前后ACE抑制率对比Fig.1 ACE inhibition rates comparison of six protease hydrolysates before and after digestion

在实验所选的六种蛋白酶中，消化处理前，Protamex、Papain、Neutrase和Alcalase的酶解产物有较高的ACE抑制率，分别为67.97%、53.75%、62.00%和51.19%，Bromelain酶解产物ACE抑制活性较低（29.24%），Flavorenzyme酶解产物ACE抑制活性最低（8.30%），不同蛋白酶解产物ACE抑制率差异显著。Lee等[25]采用碱性蛋白酶水解牛肉肌原纤维蛋白，获得ACE抑制肽Leu-Ile-Val-Gly-Ile-Ile-Arg-Cys-Val序列，体内试验表明该抑制肽对大鼠自发性高血压具有明显的降压效果。Zhang等[26]采用碱性蛋白酶和铜绿假单胞菌蛋白酶酶解小麦面筋，获得两个具有降压功能的肽段序列：SAGGYIW和APATPSFW，并发现它们在C端都含有Trp。Wu等[27]采用中性蛋白酶水解蜥鱼肌肉蛋白，并通过纯化获得序列为RVCLP的ACE抑制肽（IC50=175 μmol/L）。该多肽C末端的疏水性氨基酸Pro是使其具有较高ACE抑制活性的重要原因。研究发现，对ACE抑制肽活性的影响程度为疏水性>空间构型>电子性质，ACE抑制肽C端为疏水性结构，其C端最后3个氨基酸中含有Trp、Tyr、Phe和Pro时，ACE抑制率大大提高[28,29]。Papain能特异性对含有Leu和Gly等碱性氨基酸的肽键进行酶切，而这些氨基酸具有疏水性侧链，能有效提高ACE抑制肽的活性[28]。因此，不同蛋白酶的特异性酶切位点对ACE抑制肽的活性有很大影响，Neutrase、Alcalase、Protamex（主要成分为中性蛋白酶CAS 9080-56-2和枯草菌素蛋白酶CAS 9014-01-1）和Papain的酶解产物都具有高ACE抑制活性，但还要考察其ACE抑制肽的抗胃肠酶消化的能力。

模拟消化处理后，酶解液样品的ACE抑制活性都有一定程度的下降。Protamex酶解液的ACE抑制活性为37.26%（降低45.19%），Flavorenzyme酶解液的ACE抑制活性降低至未达检测限，Papain酶解液的ACE抑制活性为13.77%（降低74.81%），Bromelain酶解液的ACE抑制活性为22.76%（降低22.76%），Neutrase酶解液的ACE抑制活性为30.46%（降低30.46%），Alcalase酶解液的ACE抑制活性为22.56%（降低22.56%）。宋雪梅等[30]牦牛乳硬质干酪经消化酶降解后，其ACE抑制率降低了13.06%。刘鑫烔等[31]将两种皮氏蛾螺ACE抑制肽经胃液和肠液的处理后，ACE抑制率都有所下降，且处理时间越长，ACE抑制率下降程度越高。本研究中制备的牛肉蛋白酶解液经过模拟胃肠液消化后，ACE抑制活性都有不同程度降低，与前人研究结果一致，可能是消化过程中肽键断裂，活性结构被破坏，导致功能活性降低。消化后仍具有较高ACE抑制活性的是Protamex、Neutrase和Alcalase的酶解液。

2.3 不同蛋白酶酶解液的水解度

在料液比1:4（g/mL）、酶底物比4000 U/g、酶解时间4 h，各酶在2.1筛选出的pH和温度下酶解，比较Protamex、Flavorenzyme、Papain、Bromelain、Neutrase和Alcalase的牛肉蛋白酶解液水解度（DH），如图2所示。

图2 六种蛋白酶对牛肉蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of six types of protease on hydrolysis degree

由图2可知，在相同的酶底物比条件下，Protamex、Papain、Bromelain酶解液的水解度在32%～38%之间，Alcalase酶解液水解度稍高为44.76%，Flavorenzyme酶解液最高，达到了69.48%，然而其酶解液的ACE抑制活性最低。Flavorenzyme作为氨基肽酶，具有外切酶作用，主要用来解离苦味肽羧端的疏水性氨基酸，产生大量呈味游离氨基酸，常用来增咸、脱苦。常诗洁等[32]对比中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶对双孢蘑菇的酶解效果，发现Flavorenzyme水解液游离氨基酸总量及其中呈味氨基酸含量显著高于其他处理组。本研究中，Flavorenzyme酶解液具有最高的水解度测定值，说明其游离氨基酸含量最高。而Flavorenzyme的酶切特性导致多肽C端疏水性氨基酸减少，ACE抑制活性降低。因此Flavorenzyme并不适用于酶解牛肉蛋白生产ACE抑制肽。

2.4 不同蛋白酶酶解液的分子量分布

在料液比1:4（g/mL）、酶底物比4000 U/g、酶解时间4 h，各酶在2.1筛选出的pH和温度下酶解，比较Protamex、Flavorenzyme、Papain、Bromelain、Neutrase和Alcalase酶解液的SDS-PAGE分析，如图3所示。

图3 6种蛋白酶酶解后SDS-PAGE图像Fig.3 SDS-PAGE analysis of hydrolysates obtained after the hydrolysis step with six different proteinases

由图3可知，未经酶解的牛肉蛋白个中各分子量蛋白含量丰富，其中200 ku（肌球蛋白重链）、50～30 ku（肌动蛋白45 ku、原肌球蛋白35 ku）和15 ku条带丰度最高。酶解后50 ku以上条带显著减少，并产生大量游离氨基酸。Protamex酶解液泳道和Neutrase酶解液泳道还有少量30～50 ku条带保留，大部分蛋白被酶解成16～20 ku小分子蛋白和6 ku以下的多肽。Flavorenzyme酶解液泳道有明显200 ku、45 ku和35 ku条带，6 ku以下多肽较其他蛋白酶酶解液少。结合图2六种蛋白酶酶解液水解度比较可知，Flavorenzyme在酶解过程中主要发挥外切酶的作用，产生大量游离氨基酸，部分大分子蛋白结构保留。Papain和Bromelain酶解液泳道相似，30 ku以上蛋白质被全部酶解，生成16 ku以下多肽。Alcalase酶解液泳道蛋白分解程度最高，大分子蛋白质基本全部被酶解成6 ku以下多肽。综上所述，Papain、Bromelain和Alcalase对于牛肉蛋白有更好的酶解效果，这一结论与其他学者[33,34]一致。

2.5 不同蛋白酶酶解液的感官评价

在料液比1:4（g/mL）、酶底物比4000 U/g、酶解时间4 h，各酶在2.1筛选出的pH和温度下酶解，比较Protamex、Flavorenzyme、Papain、Bromelain、Neutrase、Alcalase酶解液和胶原蛋白肽（牛皮）溶液的感官评价，如图4所示。

图4 不同蛋白酶对牛肉酶解液感官评价得分的影响Fig.4 Effects of different proteases on sensory evaluation scores of beef enzymatic hydrolysate

由图4可知，与市售商品胶原蛋白肽（牛皮）的溶液相比，牛肉酶解液的外观和气味得分更高。在滋味方面，牛肉酶解液的鲜味和牛肉特征味得分明显高于胶原蛋白肽溶液，这可能是牛肉蛋白酶解过程中释放大量游离氨基酸导致的，因此，且基本无苦味。其中Flavorenzyme的牛肉水解液鲜味最优，可能是酶解时产生大量谷氨酸等鲜味氨基酸[35]。综合来看，六种蛋白酶的牛肉酶解液与市售商品胶原蛋白肽（牛皮）的溶液差异不大，无明显不良风味产生，可用于食品辅料的生产。

3 结论

本试验采用复合蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶6种酶制备牛肉酶解液，比较其ACE抑制活性、水解度、分子量分布和感官等方面特性。经组间对比碱性蛋白酶解液兼具以上几个指标参数的优势，其酶解液ACE抑制率为51.19%，水解度为44.76%。基于此研究结果，本研究将继续通过单因素实验和多因素响应面分析进行优化，获得碱性蛋白酶最佳酶解参数，制备兼具营养与活性功能的牛肉降血压肽，使人们更深入地开发牛肉的营养和功能。