基于GC-MS指纹图谱及化学模式识别分析河南不同产地香椿挥发性成分

赵丽丽，程菁菁，王赵改，史冠莹，张 乐，王晓敏，蒋鹏飞，王旭增

（河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南 郑州 450000）

香椿（Toona sinensis(A.Juss.) Roem）为楝科香椿属落叶乔木[1]，是我国重要的特产木本风味植物资源之一，已有2 300多年的栽培历史[2]。香椿营养价值丰富，具有显著的抗氧化、抑菌、抗癌及降血糖活性[3-9]。此外，香椿因其浓郁的特征香气而备受青睐，其所含有的独特挥发性成分是区别于其他蔬菜的关键，直接决定其食用价值、商品价值及产业前景[10]。河南为香椿的主栽产地，种植面积大，目前已在郑州、中牟、登封、许昌、焦作、安阳、驻马店、桐柏等地形成千亩基地近20 个，已发展成我省“富民工程”的现代特色农业[11-12]。但受栽培地区土壤、气候等多种因素影响，不同地区香椿特有风味存在差异，使其在深加工应用领域受到一定程度的限制[13-15]，故快速有效鉴定香椿挥发性成分并获取其产地信息，客观评价并控制其质量是亟需解决的问题。

气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）指纹图谱是指样品经适当处理后，采用GC-MS检测得到的，能够标示样品中各组分共有峰的图谱[16]。该图谱能够将食品中特有的挥发性成分通过特定信息化处理，对食品进行分析识别，具有整体性、全面性和唯一性，可用于产品产地溯源、真假识别及质量优劣判别，目前已被广泛应用于茶叶、蜂蜜、葡萄酒及其他食品的气味识别研究[17-18]。龙立梅等[19]采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）与GC-MS联用技术，建立不同等级信阳毛尖茶GC-MS指纹图谱，为绿茶的品质区分和分等定级提供了一种客观量化的方法选择；王华堂等[20]采用HS-SPME和GC-MS联用法，分别建立蜂龙眼蜜和意蜂龙眼蜜挥发性成分GC-MS指纹图谱，为蜂蜜的科学评价提供参考；王红广等[21]采用HS-SPME与GC-MS联用技术，构建山西老陈醋香气的GC-MS指纹图谱，并借助聚类分析结合香气风味特性分析实现了对山西老陈醋的身份识别。

化学模式识别技术是利用统计学、信号处理、数学算法等工具，从化学量测数据推理出物质类的本质属性，进而对物质进行识别和归类的一门技术[22]。其能够较好地迎合指纹图谱整体性和模糊性的要求，分为无监督模式识别方法和有监督模式识别方法2 类[23-24]。无监督模式识别是指在无样品类别信息的情况下，进行学习或训练，获取分类信息的方法；有监督模式识别则是根据样品特征和已知类别的样品（训练集），用特定的方法或模型进行学习或训练，从而建立分类模型，再根据获取的分类模型和未知样品的特征，对未知样品进行 分类[25]。其中无监督的模式识别方法包括聚类分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）等。有监督的模式识别方法包括簇类独立软模式法、判别分析、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）、人工神经网络等[25]。目前，化学模式识别技术已被应用于中药及食品质量控制方面。青旺旺等[26]采用GC指纹图谱结合化学模式识别，实现了20 批沉香化气片的区分，并发现造成不同批次样品差异的主要标记物，为科学评价与有效控制沉香化气片的质量提供了可靠参考。蔡玮琦等[27]采用高效液相色谱指纹图谱结合化学模式识别技术，将红糖、白砂糖、赤砂糖、黑糖进行有效区分，并找到了主要差异性成分。然而，目前国内外鲜见使用GC-MS指纹图谱技术结合化学模式识别（PCA及CA）进行香椿产地溯源的研究。

本研究拟以河南省不同地域来源的香椿嫩芽为对象，采用HS-SPME-GC-MS技术，首次将“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”引入香椿复杂风味体系，构建香椿挥发性成分GC-MS指纹图谱，并结合化学模式识别分析，以期探索和建立一种判别香椿地理源的方法，为香椿的快速溯源、品质控制和食品安全提供一定的理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

17 批次香椿样品分别取自河南省8 个不同地区不同采收期，其中S1～S16 16 批次香椿样品主要用于GC-MS指纹图谱的构建及化学模式识别，S17样品用于方法验证，其具体产地和采集时间见表1；液氮购自郑州博越商贸股份有限公司。

表1 香椿样品的来源Table 1 Sources of T. sinensis samples tested in this study

1.2 仪器与设备

7890A-5975C GC-MS联用仪、HS-SPME装置（包括手持式手柄、50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头、20 mL带硅胶垫棕色顶 空瓶） 美国安捷伦公司；ME204E型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；IKA A11液氮研磨机 艾卡（广州）仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME条件

取新鲜香椿，添加适量液氮，使用液氮研磨机进行粉碎。准确称取（1.00±0.003）g于20 mL带有硅胶垫的棕色顶空瓶中，密封后于40 ℃水浴中平衡15 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，萃取头距离样品约1 cm，萃取30 min后取出萃取头，插入GC-MS进样口解吸5 min，同时开始采集保留时间和色谱峰强度等相关数据。

1.3.2 GC-MS联用条件

GC条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初温40 ℃，保持3 min， 以5 ℃/min速率升温至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min速率升温至220 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃；载气He，流速1.0 mL/min；不分流进样。

MS条件：电子电离源；扫描方式为全扫描；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度250 ℃；溶剂延迟3 min；质量扫描范围m/z40～800；检索图库为NIST 08.LIB。

1.3.3 方法学考察

精密度实验：取同一香椿供试样品，按照1.3.2节条件，连续进样3 次，计算各共有峰保留时间和峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

重复性实验：取同一香椿样品，平行准备3 份供试样品，按照1.3.2节条件，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD。

稳定性实验：取同一香椿供试样品，按照1.3.2节条件，分别于第0、12、24小时进样，计算各共有峰保留时间和峰面积的RSD。

1.4 数据处理

用标准图谱进行检索分析、定性；将相似度大于800的峰作为确认，用峰面积归一法计算各组分的相对含量。8 个不同产地16 批香椿样品的GC-MS分析结果，根据相对保留时间和峰面积选取共有峰，采用SPSS 19.0软件进行CA和PCA。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

精密度实验结果表明，各共有峰保留时间的RSD均小于0.17%，峰面积的RSD均小于1.87%，表明仪器精密度良好。重复性实验结果表明，各共有峰保留时间的RSD均小于0.24%，峰面积的RSD均小于5.11%，表明该方法重复性良好。稳定性结果表明，各共有峰保留时间的RSD均小于0.13%，峰面积的RSD均小于2.02%，表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.2 香椿中挥发性成分的种类及相对含量

将从河南省8 个不同产地16 批次香椿嫩芽样品中鉴别出的248 种挥发性成分进行分类汇总，发现香椿嫩芽样品中的挥发性成分主要分属于醇类、含硫类、萜烯类、萜烯类氧化物、醛类、烷烃类、酯类、酸类、酮类和其他类。其中含硫类的相对含量最高，达52.84%；萜烯类和醛类的相对含量次之，分别为20.91%和17.67%；其他类别挥发性物质的相对含量均小于3.5%（图1）。

图1 16 种香椿嫩芽中挥发性化合物的相对含量Fig. 1 Relative contents of volatile compounds in 16 samples of T. sinensis

2.3 指纹图谱的构建及共有模式的建立

中药色谱指纹图谱相似度评价系统是通过数据处理软件对多个中药样品指纹图谱进行峰匹配，提取共有峰后，利用相似度判定指纹图谱间的相似程度[28]。刘江等[24]统计发现指纹图谱的建立，以色谱方法居多，且高效液相色谱和GC被认为是制订指纹图谱标准的理想方法，GC更是在分析挥发性组分方面具有优势。由于香椿具有类似于中药的复杂体系，因此应用指纹图谱技术可以有效表征香椿挥发性成分。

将河南不同产地16 批次香椿嫩芽样品挥发性成分的保留时间和峰面积数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（中国药典委员会2004A版）”进行图谱分析，以样品S1的色谱峰为参照峰，时间宽度设为0.10 s。为提高相似度结果的可靠性，将多个共有色谱峰的保留时间校正后进行自动匹配，生成对照指纹图谱（R）和16 批次香椿嫩芽样品挥发性成分的GC-MS标准指纹图谱 （图2），共确认出6 个共有峰，并通过NIST 08.LIB标准谱库检索，查阅相关文献资料，鉴定出该6 个共有峰的化学组成（表2）。结果表明不同产地香椿嫩芽挥发性成分的GC-MS指纹图谱共有峰的相对保留时间差别较小，RSD在0.01%～0.31%之间，说明16 批次香椿嫩芽样品挥发性特征成分基本相同。但其共有峰的相对峰面积差别较大，RSD在33.71%～114.77%之间，表明16 批次香椿嫩芽挥发性物质的主要特征成分含量差别较大，其主要受产地、生长期等条件影响，该结果与王晓敏[15]、 杨慧[29]等的结果一致。

图2 16 批香椿嫩芽样品挥发性成分的GC-MS指纹图谱和对照指纹图谱Fig. 2 GC-MS fingerprints of volatile components from 16 batches of T. sinensis tender buds and reference fingerprints

表2 16 批香椿嫩芽样品挥发性成分GC-MS指纹图谱中 6 个共有峰鉴定结果Table 2 Identification of six peaks common to GC-MS fingerprints of volatile components from 16 batches of T. sinensis tender buds

2.4 相似度分析

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（中国药典委员会2004A版）”，以样品S1的色谱图作为参照图谱，进行相似度评价，结果见表3，参照图谱与其余15 批香椿嫩芽样品图谱相似度为0.198～0.992。样品S2、S3与样品S1最为接近，相似度大于0.99；样品S6、S12、S14与样品S1比较接近，相似度大于0.9；样品S5、S7、S11、S13与样品S1相似度大于0.8；样品S9、S10、S16与样品S1差异最大，相似度分别为0.198、0.495、0.512。因此，可以说明同一产地、同一采收期的香椿挥发性成分最相似，不同生长环境（高山、平原）的差异最显著。

表3 共有模式下香椿嫩芽样品的相似度评价结果Table 3 Similarity in volatile components among 16 batches of T. sinensis tender buds

2.5 化学模式识别

2.5.1 CA

CA法是一种常用的指纹图谱技术质量评价方法，对没有样本所属类别信息的物质，以分类图形式进行直观的系统分析，适用于对大批量样品进行快速分类或身份识别[23]。将16 批香椿嫩芽样品6 个共有峰的峰面积作为变量，得到16×6阶原始数据，导入SPSS 19.0软件进行CA，采用组间连接法，以欧氏距离平方为分类依据，相似度越大，2 个样品之间的距离越近[30]。

如图3所示，当类间距为25时，可将河南省不同产地16 批次香椿嫩芽挥发性成分聚为2 类，其中样品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S11、S12、S13、S14聚为第1类，样品S4、S8、S9、S10、S15、S16聚为第2类。对照表1发现，第1类样品多为头茬，且产地均为平原，因此很好地聚为1 类；第2类样品多为二茬，且许昌、信阳2 个产地样品均采自高山，因此聚为1 类。

图3 香椿嫩芽样品挥发性成分的CA树状图Fig. 3 Cluster analysis dendrogram of volatile components from T. sinensis buds

当类间距为5时，根据第1类样品之间的差异又可将其分为3 类，样品S5、S7、S11、S12聚为1 类，均集中在河南东部地区；样品S1、S3、S6、S13、S14为1 类，产地大多集中在河南西部地区；S2单独聚为1 类。当类间距为8时，根据第2类样品之间的差异可将其分为3 类，样品S9、S10均采自高山地区，被聚为1 类；样品S4、S8、S15，其中S4、S8均为平原栽种，采收期相同，被聚为1 类；样品S16采自高山地区，单独聚为1 类。以上分析结果表明，在河南范围内，采收期及产地（地理位置、海拔高度等）对香椿嫩芽挥发性成分具有显著影响。朱永清等[31]同样采用HS-SPME-GC-MS方法研究了“巴山红”香椿芽叶5 个不同发育时期挥发性物质的组成特征，结果表明在不同发育时期挥发性组分的种类及相对含量具有明显差异；王晓敏等[15]亦采用HS-SPME-GC-MS方法发现河南4 个产地香椿挥发性风味物质呈现明显地域差异性。因此，本研究所得结果与文献结果一致，且与相似度评价结果一致。

2.5.2 PCA

PCA是一种能够将多个变量通过线性变换选出较少个数重要变量的一种多元统计方法[32]。以河南不同产地16 批香椿嫩芽样品6 个共有峰的峰面积为变量形成16×6阶数据，将该数据导入SPSS 19.0软件中，选择分析-降维-因子分析，在描述中选择系数、显著性水平和行列式，在旋转中选择最大方差法，输出载荷图，使用正交旋转法进行PCA，得到前3 个PC的特征值分别为2.196、1.630、1.050（均大于1），累计方差贡献率达81.257%，超过80%，说明前3 个PC综合了16 批香椿样品挥发性成分的绝大部分原始变量信息，能代表样品挥发性成分的主要特征（表4）。如图4所示，以空间散点的距离分，样品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S11、S12、S13、S14的PC相较于其他样品较为相近，聚为1 类；样品S4、S8、S9、S10、S15、S16的PC较为相近聚为第2类，不同样品的挥发性成分之间存在明显差异，PCA可将河南不同产地香椿进行有效区分，该结果与相似度评价及CA结果一致。

表4 PC总方差解释Table 4 Eigenvalues and contributions to total variance of PC

图4 香椿嫩芽样品挥发性成分的PCA得分图Fig. 4 PCA score plot of volatile components in T. sinensis buds

PCA载荷反映了各变量对PC的贡献大小和贡献方向，其绝对值越大，表明该变量对PC的贡献越大，正负反映方向[33]。如图5所示。在PC1上，共有物质2-己烯醛具有较高的正载荷，2,4-二甲基噻吩有较高的负载荷，说明PC1反映2-己烯醛和2,4-二甲基噻吩提供得到的综合信息。含硫类物质一般具有较低的感知阈值（能够感觉到有气味的最小浓度）和较强的气味，呈现出类似于大蒜、韭菜、洋葱等刺激性气味[34]，2,4-二甲基噻吩可能是由双(1-丙烯基)二硫化物在经过高温加热后首先转化 为2-巯基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩，再进一步加热降解所得[35-36]。醛类也是构成香椿主要香气特征的一大类 物质[34]。Yang Wenxi[37]和Zhai Xiaoting[38]等采用分子感官技术均发现双(1-丙烯基)二硫化物、己醛、反-2-己烯醛等为构成新鲜香椿独特气味的主要贡献化合物。在PC2上，共有物质乙酸法呢醇酯表现出较高的正载荷，说明PC2反映乙酸法呢醇酯提供得到的信息。同理，PC3反映2-甲基-3-亚甲基-环戊烷甲醛提供得到的信息，表现出较高的正载荷。由此可以说明，2-己烯醛、2,4-二甲基噻吩、乙酸法呢醇酯及2-甲基-3-亚甲基-环戊烷甲醛是造成河南省不同产地不同采收期香椿嫩芽样品中挥发性成分差异显著的主要物质。2-己烯醛、2-甲基-3-亚甲基-环戊烷甲醛赋予香椿青香和草香，2,4-二甲基噻吩赋予香椿硫磺及蒜臭类辛辣刺激性气味，乙酸法呢醇酯赋予香椿花香，共同对香椿嫩芽的整体风味起重要贡献作用[39]。

图5 香椿嫩芽样品挥发性成分的PCA载荷图Fig. 5 PCA loading plot of volatile components in T. sinensis buds

通过累计方差贡献率提取的3 个PC为综合评价指标，计算得到河南省16 批香椿嫩芽样品挥发性成分的PC得分及综合得分见表5。由表5可知，S16、S15香椿样品的挥发性成分综合得分最高。由于香椿独特挥发性成分是决定香椿品质的关键影响因素，从香椿风味的角度，可以说明信阳高山栽种的香椿嫩芽品质最优，这可能是由于信阳高山气候、土壤因子以及植被等综合天然生态条件较适合香椿生长的缘故。因此，在选择加工原料来源时，可根据产品要求选择适宜产地取材。

表5 标准化后PC综合得分Table 5 Comprehensive scores of PC after standardization

2.6 方法验证

基于本实验建立的河南不同产地香椿挥发性成分GC-MS指纹图谱及化学模式识别分析，将采集到的驻马店三茬香椿样品（编号S17）挥发性成分6 个共有物质的GC-MS色谱峰峰面积数据代入SPSS 19.0软件进行CA。如图6所示，样品S17、S11、S12明显聚为1 类，说明样品S17与样品S11、S12归属于同一产地，能够快速确定样品S17来源于河南驻马店。因此本实验建立的GC-MS指纹图谱结合化学模式识别方法对于河南不同产地香椿样品的快速溯源具有较强的指导意义和实用参考价值。

图6 香椿嫩芽样品挥发性成分的CA树状图Fig. 6 Cluster analysis dendrogram of volatile components from T. sinensis buds

3 结 论

本实验将“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”引入香椿复杂风味体系中，构建了河南省8 个不同产地16 批次香椿嫩芽挥发性成分的GC-MS指纹图谱，共确定出6 个共有峰，并鉴定出其化学成分分别为2-己烯醛、2,4-二甲基噻吩、2-甲基-3-亚甲基-环戊烷甲醛、β-紫罗兰酮、1-氧阿司匹林[2.5]辛烷.5-5-二甲基-4-(3-甲基-1,3-丁二烯)、乙酸法呢醇酯。

根据中药指纹图谱相似度评价结果结合共有成分CA、PCA结果，发现河南省内不同产地、采收期的香椿嫩芽挥发性成分存在较大的差异。不同产地和采收期对香椿嫩芽挥发性成分影响显著，同一生长期采收的样品被很好地聚为一类，东部和西部、高山和平原栽种的样品也能被很好地区分开。此外，PCA找到了引起不同批次香椿嫩芽样品间风味差异的主要成分为2-己烯醛、 2,4-二甲基噻吩、乙酸法呢醇酯及2-甲基-3-亚甲基-环戊烷甲醛，同时发现信阳高山种植的香椿挥发性成分综合得分最高。最后通过CA对未知产地香椿进行归类，能够快速鉴定出其产地来源。以上结果表明GC-MS指纹图谱结合化学模式识别能够明确不同生长期、不同地域香椿品质的差异，找出对香椿风味具有贡献的特征香气成分，为香椿的快速溯源、品质监控和食品安全供应提供一定的理论基础和技术支撑。