GC-IMS结合化学计量学分析不同采后处理对 柑橘果皮挥发性化合物的影响

李 湘，江 靖，李高阳，单 杨，朱向荣

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125；3.果蔬贮藏加工与质量安全湖南省重点实验室，湖南 长沙 410125；4.果蔬贮藏加工与质量安全国际联合实验室，湖南 长沙 410125）

柑橘是我国第一大水果，种植面积和产量均居世界第一[1]。柑橘果肉多汁，营养价值丰富，深受消费者喜爱[2]。但柑橘在采后贮藏期间，易感染青霉病、绿霉病和酸腐病等病害[3-4]，引起腐烂变质，其腐损率高达20%～30%，造成巨大的经济损失，且污染环境[5]。目前，国内外研究者开发了许多柑橘采后保鲜技术，如化学防腐、物理保鲜和生物保鲜等，都可以降低柑橘果实腐烂，延长货架期[6]。

热处理（heat treatment，HT）是目前公认的绿色环保型保鲜处理手段，可抑制病原菌的生长，降低果蔬病害发生率[7]。HT在柑橘采后指状青霉菌的抑制[8]、甜瓜腐烂率降低[9]方面发挥着较大作用。温州蜜橘经HT，果皮中抗性相关蛋白、木质素及黄酮类物质等主要代谢产物含量增加，这对果实抗病性具有重要意义[10]。臭氧具有分解快、残留效应小等特点，是普遍公认安全性的食品防腐剂替代品[11]。适当的臭氧处理可诱导与抗氧化、抗菌活性相关的初级代谢产物参与果实衰老和病害调控，果实产生抗性，抑制葡萄、木瓜和蘑菇等果蔬致病菌菌丝的生长[12-14]。但以上研究多从次生代谢产物变化入手，而对挥发性成分变化研究较少。柑橘等水果果皮包含柠檬烯、芳樟醇、辛醛、癸醛、γ-松油烯和α-松油醇等主要挥发性成分，对霉菌具有较强的抑制活性[15]。因而分析挥发性成分变化与果蔬抑菌保鲜的联系有重要意义。

气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术和气相色谱-离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GCIMS）技术是分析挥发性化合物中常用的技术手段。与GC-MS相比，GC-IMS是利用GC在极短时间内分离复杂混合物，使混合物成为单一组分后，根据气相离子迁移率对化合物进行表征的方法，检测灵敏度达十亿分之一，具有极高的分辨率、分析速度快等优点[16-17]。近年来，GC-IMS被广泛应用于食品中的挥发性化合物分析、食品掺假鉴别及品种溯源等领域[18-21]。

本研究采用HT和臭氧熏蒸（ozone fumigation，OF）对柑橘进行采后处理，利用GC-IMS技术快速检测柑橘果皮中挥发性化合物，并结合主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）法，分析处理前后柑橘果皮挥发性化合物的变化，鉴定与诱导抗性相关的化合物，以期为柑橘采后绿色保鲜技术的使用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

温州蜜橘，产自湖南郴州东江湖，2019年9月10日购自湖南长沙市毛家桥水果市场。

FlavourSpec®风味分析仪 山东海能科学仪器有限 公司；HH-8数显电热恒温水浴锅 常州亿通分析仪器制造有限公司；气调保鲜试验箱 杭州屹石科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

挑选无损伤、外观颜色、大小相近的温州蜜橘，洗净并晾干，经HT（50 ℃水浴2 min）和OF（熏蒸30 min）后，剥取果皮，置于－80 ℃冰箱中冷冻保存。不经处理的温州蜜橘作对照（CK）。随机分别称取CK、HT、OF柑橘果皮样品1 g，置于20 mL顶空瓶中，每组取3 个样品，测3 次平行。

1.2.2 GC-IMS分析条件

分析时间：20 min；色谱柱类型：FS-SE-54-CB-1（15 m×0.53 mm）；柱温：60 ℃；载气/漂移气：N2；IMS温度：45 ℃；采用自动顶空进样，进样体积为200 μL；孵育时间：15 min；孵育温度：40 ℃；进样针温度：65 ℃；孵化转速：500 r/min。

1.3 数据处理

利用仪器配套的分析软件包括LAV（Laboratory Analytical Viewer）和3 款插件（Reporter插件、Gallery Plot插件、Dynamic PCA插件）以及GC×IMS Library Search从不同角度进行样品分析；采用Origin 2020软件中的Heat map with dendrogram插件绘制聚类分析热图；采用SIMCA 14.1进行PLS-DA。

2 结果与分析

2.1 不同处理柑橘果皮中挥发性化合物GC-IMS分析

使用Reporter插件生成了不同处理柑橘果皮中挥发性化合物的GC-IMS二维俯视图，如图1所示，左侧红色竖线为反应离子峰（reaction ion peak，RIP），整个背景图为蓝色，反应离子峰右侧每一点代表一种挥发性化合物，颜色深浅程度代表挥发性化合物含量，白色区域代表化合物含量低，红色区域代表化合物含量高。如图1所示，大部分信号出现在迁移时间1.0～1.8 ms和保留时间100～700 s的区域，不同处理组与CK组中A、B区域相比较，红点区域变大、颜色变深，说明HT和OF能使柑橘果皮挥发性化合物含量增加。

图1 不同处理柑橘果皮中挥发性化合物GC-IMS二维俯视图Fig. 1 Two-dimensional GC-IMS topographic maps of volatile compounds in citrus peel under different treatments

2.2 不同处理柑橘果皮中挥发性化合物定性分析

利用离子迁移时间和保留指数对挥发性化合物进行定性鉴别，柑橘果皮挥发性部分化合物会产生二聚体甚至三聚体，它们保留时间相近，但迁移时间 不同[22]。柑橘果皮挥发性化合物定性分析如图2所示，CK、HT和OF样品中挥发性化合物图谱基本一致，但化合物含量存在差异。

图2 柑橘果皮中挥发性化合物信号峰位置点Fig. 2 Signal peak location points of volatile compounds in citrus peel

从GC×IMS文库中共鉴定出49 种典型化合物，表1 列出了样品中所有已鉴定的物质，化合物属性包括名称、保留指数、保留时间和迁移时间。结果显示，柑橘果皮中挥发性化合物包括13 种醇类、12 种醛类、9 种萜烯类、7 种酯类、4 种酮类、3 种呋喃类和1 种酸类。

表1 柑橘果皮中挥发性化合物的定性测定Table 1 Volatile compounds identified by GC-IMS in citrus peel

2.3 不同处理柑橘果皮中挥发性成分的指纹图谱分析

根据Gallery Plot插件生成的不同处理柑橘果皮的指纹图谱，能直观且定量地比较不同处理样品之间挥发性化合物差异。图中每行代表一个柑橘果皮样品中所含的挥发性化合物，每列表示不同样品之间同一种挥发性化合物的对比。颜色深浅程度代表挥发性化合物的含量，颜色越亮，含量越高。如图3所示，对照组与两个处理组样品差异显著，如CK样品中丙醛、3-甲基丁醛、丁醛、乙缩醛、3-羟基丁酮、2-丁酮、丙酮和乙酸等含量较高，但总体而言，从图3可知，处理组样品中许多挥发性化合物含量高于对照组，OF处理样品中α-松油醇、β-松油醇、苯甲醛、2-乙酰基呋喃、2-乙基呋喃、1-戊醇、甲酸乙酯、2-己酮等含量较高，HT处理样品中丁酸丙酯、正己醇、丙酸乙酯等含量较高。

图3 不同处理柑橘果皮中挥发性化合物的指纹图谱Fig. 3 Fingerprints of volatile compounds in citrus peel under different treatments

2.4 不同处理柑橘果皮挥发性化合物的PCA

PCA核心思想是降低由大量相关变量组成的数据集维数，同时尽可能保留数据集中存在的变化[23]。使用Dynamic PCA插件对不同处理的柑橘果皮样品进行PCA。本实验对不同处理的柑橘果皮挥发性化合物含量进行PCA，对数据进行可视化处理，并给出前2 个PC的分布图。一般来说，累计方差贡献率达到80%以上的前几个PC，都可以选作最后的PC，实现对数据的区分。结果表明，前2 个PC方差贡献率分别为66.4%和14.2%。如图4所示，基于挥发性化合物含量的差异，PCA可以将CK、HT、OF不同组样品进行有效区分。

图4 不同处理样品中挥发性化合物的PCA图Fig. 4 PCA plot for discriminating volatile compounds in different treated samples

2.5 不同处理样品挥发性化合物的PLS-DA

PLS-DA与PCA是通过降维将复杂数据直观化，与PCA不同的是，PLS-DA是有监督的分析，属于模型的方法。有监督的PLS-DA有助于高维数据的可视化、判别分析与代谢变化有关的潜在代谢物。另外，在PLS-DA中使用交叉验证和置换检验可以评价模型的性能指标[24]。经PLS-DA，R2X=0.989，R2Y=0.999，Q2=0.983，R2X和R2Y分别表示模型所能解释X和Y矩阵信息的百分比，R2X－R2Y＜0.3代表该模型较可靠。使用置换检验的方法对PLS-DA进行验证，次数为200 次，得到检验统计量评估模型拟合的质量。图5是PLS-DA置换检验结果，右侧是原始值，左侧是模拟值，所有左侧的R2和Q2均比右侧低，R2和Q2的回归线斜率大于1，且Q2的回归线截距为负值，说明该模型稳定性较好，未出现过拟合现象，具有较好的预测能力[25]。

图5 柑橘果皮中挥发性化合物PLS-DA Permutations图Fig. 5 Permutation test plot of volatile compounds in citrus peel

2.6 不同处理柑橘果皮标志挥发性化合物分析

PLS-DA载荷图通过扩大组间差异、减少组内差异的分析方法寻找标记物，每一个点代表一种挥发性化合物，距离原点越远的挥发性化合物被认为对样本的分类贡献最大。变量投影重要性（variable important in the projection，VIP）通过PLS-DA载荷图判别所得，一般VIP＞1表示在判别过程中具有重要作用。VIP值越大，说明在不同处理下该挥发性化合物的差异越显著[25]。共筛选出17 种标志挥发性化合物，在图6中以红色显示。为了分析不同处理下柑橘果皮标志挥发性化合物变化，根据标志挥发性化合物的峰值强度进行热图聚类分析。如图7所示，HT与OF柑橘果皮中标志挥发性化合物较为相似，其中I区域中挥发性化合物经HT和OF处理，其含量增加；II区域中挥发性化合物含量经过HT和OF处理呈下降趋势。

图6 柑橘果皮中挥发性化合物PLS-DA载荷图Fig. 6 PLS-DA loading plot for volatile compounds in citrus peel

图7 柑橘果皮中标志挥发性化合物聚类分析的热图Fig. 7 Cluster heat map of volatile marker compounds in citrus peel

2.6.1 柑橘果皮中醇类及醛类物质的变化

利用GC-IMS从柑橘果皮中共检测出13 种醇类物质（表1），经PLS-DA，5 种醇类物质是标志挥发性化合物，包括α-松油醇、β-松油醇、反-2-己烯醇（D）、正己醇、乙醇（D）（图7）。经HT和OF处理，这些醇类物质总含量增加，与CK组样品差异显著（P＜0.05） （表2）。HT和OF处理后，4 种标志醇类化合物含量显著增加，而反-2-己烯醇（D）含量显著降低。利用GCIMS从柑橘果皮中共检测出12 种醛类物质（表1），经PLS-DA，4 种醛类物质是标志挥发性化合物，包括癸醛（M）、癸醛（D）、正己醛、乙缩醛（图7），经HT和OF处理样品，标志醛类化合物总含量呈下降趋势，且不同处理之间差异显著（P＜0.05）（表2），只有癸醛（D）经HT处理后含量显著增加。

表2 柑橘果皮中标志挥发性成分峰值强度Table 2 Peak intensities of volatile marker component in citrus peelmV

2.6.2 柑橘果皮中酯类物质的变化

利用GC-IMS从柑橘果皮中共检测出7 种酯类物质（表1），经PLS-DA，4 种酯类物质是标志挥发性化合物，包括丁酸丙酯（D）、丙酸乙酯（D）、乙酸乙酯（M）、甲酸乙酯（图7），经HT和OF，标志酯类化合物总含量显著增加，与CK组样品差异显著（P＜0.05）（表2），以上4 种酯类化合物含量呈显著上升趋势。

2.6.3 柑橘果皮中萜烯类物质的变化

利用GC-IMS从柑橘果皮中共检测出9 种萜烯类物质（表1），经PLS-DA，只有α-葑烯是标志挥发性化合物（图7），经HT和OF处理样品，α-葑烯含量有少量的增加，不同处理之间差异不显著（表2）。

2.6.4 柑橘果皮中酮类及呋喃类物质的变化

利用GC-IMS从柑橘果皮中共检测出4 种酮类物质（表1），经PLS-DA，只有2-丁酮和丙酮是标志挥发性化合物（图7），经HT和OF处理样品，这些酮类物质总含量显著下降，与CK样品差异显著（P＜0.05） （表2）。从柑橘果皮中共检测出3 种呋喃类物质，经PLS-DA，只有2-乙基呋喃是标志挥发性化合物 （图7），经OF处理样品，其含量增加，与CK、HT处理样品差异显著（P＜0.05）（表2）。

3 讨 论

本研究对柑橘进行HT和OF处理后，采用GC-IMS检测分析不同处理前后挥发性化合物的变化，结果表明，许多挥发性化合物显著增加，主要包括醇类、醛类、酯类和萜烯类。这些化合物构成了水果特有的香味，并有助于提高水果的风味[26]。芳樟醇、α-松油醇作为山茱萸挥发油的成分，具有抗氧化活性和体外抗菌活性，经HT和OF处理，α-松油醇含量显著增加[27]。因成熟度增加反-2-己烯醇含量减少[28]。柑橘果皮油的主要成分包括辛醛、癸醛、香叶醛等醛类和芳樟醇、α-松油醇、香叶醇等醇类物质，其具有较强的抗真菌活性，其中的辛醛、癸醛、芳樟醇及α-松油醇在本实验中均鉴定出，经HT和OF处理，癸醛和α-松油醇含量增加[29]。在水果果实成熟和衰老过程中，其果皮中醛类物质含量趋于下降，这与本研究中标志性醛类化合物总含量呈下降趋势一致[26]。臭氧处理能显著延缓火龙果果实的衰老，在此过程中 2-庚醛、2-辛烯醛和4-庚醛含量显著增加[30]。癸醛也是甜橙皮精油的主要醛类[31]。以上研究表明，挥发性醛类可能是温州蜜橘果皮代谢的产物。在本研究中，癸醛可能在提高果实抗病性中起到积极作用。

天然的风味和芳香源于多种化合物的复杂混合物，挥发性酯类是主要成分[32]。乙酸芳樟酯是柠檬叶精油中主要化合物，柠檬叶精油可作用于细菌细胞壁和质膜，其被视为合成抗菌素的天然替代品[33]。柑橘经臭氧处理后，其果皮中乙酸橙花酯、乙酸香叶酯和乙酸辛酯含量显著增加，这可能与延缓果实采后贮藏中的腐烂有关[34]。碳氢酯，尤其是乙酸辛酯等酯类化合物具有较强的清除自由基和抗菌活性[35]。乙酸橙花酯、乙酸香叶酯作为柑橘果皮油的主要成分，对细菌及真菌具有较强抑菌效果[29]。在本研究中，经HT和OF处理，丁酸丙酯、丙酸乙酯、乙酸乙酯和甲酸乙酯等酯类化合物含量显著增加。

萜烯类物质在植物精油成分中占有重要地位，植物精油的抑菌活性与其化学成分有关，牛至精油和罗勒精油的主要成分是萜烯类化合物，能破环菌体细胞膜达到抑制菌体生长的目的[36]。经PLS-DA，只有α-葑烯是标志萜烯类化合物，但β-罗勒烯（D）等其他萜烯类物质亦少量增加。α-蒎烯、柠檬烯、β-月桂烯、β-石竹烯、β-蒎烯等烯萜类成分对炭疽菌、灰霉病等植物真菌的生长有较强的抑制作用[37]。柠檬烯、β-罗勒烯、α-松油烯作为益母草的主要成分，β-罗勒烯、β-石竹烯作为锦葵花叶挥发油的主要成分，两者均具有广谱抗菌活性[38]。白鲜叶和茎中提取的精油，萜烯类化合物所占比例最高（66.7%），其通过破坏细胞壁表现出对真菌的较强抑制能力，从而具有开发天然抗真菌药物的潜力[39]。萜烯类作为陈皮挥发油的主要成分，其对革兰氏阳性菌有不同程度的抗菌活性[40]。综上所述，经HT和OF处理，含量增加的醇类、醛类、酯类和萜烯类化合物大都具有抗菌活性。

4 结 论

本研究采用HT和OF对柑橘进行采后处理，使用 GC-IMS技术对柑橘果皮中挥发性化合物进行有效的分离、检测，共鉴定出49 种化合物，包括13 种醇类、12 种醛类、9 种萜烯类、7 种酯类、4 种酮类、3 种呋喃类、1 种酸类。结合PCA和PLS-DA研究处理前后柑橘果皮挥发性化合物的变化，筛选出17 个标志挥发性化合物，并对其进行分析，结果发现，经HT和OF处理样品，醇类、醛类、酯类和萜烯类化合物含量增加，并具有抗菌活性。因此，采用HT和OF技术能增强果实抗病性，延缓采后腐烂，延长果实货架期，在柑橘贮藏保鲜中具有重要的意义。