粪便移植对铅暴露肥胖孕鼠子代肠道微生态及神经行为的作用研究

陈小君，孟淑娟，吴 磊，曹福源，张艳淑,4

(1.华北理工大学公共卫生学院，河北 唐山 063000；2.曹妃甸区工人医院，河北 唐山 063000；3.唐山弘慈医院，河北 唐山 063000；4.华北理工大学实验动物中心，河北 唐山 063000)

长期慢性铅暴露可导致认知功能障碍、神经抑郁样改变、锥体外系改变等症状[1-3]。随着人们生活方式发生改变，高脂高糖饮食导致的肥胖发生率迅速上升。世卫组织估计到2025年，全球超重或肥胖儿童将超过7000万，肥胖成人将超过8亿[4]。肥胖不仅影响个体健康，还会对子代健康造成不利影响。

肠道菌群寄居在肠道，与宿主长期共存，并参与宿主的营养、代谢、免疫等生理功能[5-6]。有研究表明肠道菌群结构失调在肥胖及中枢神经系统疾病的发生、发展中发挥重要作用[7]。基于微生物-肠-脑轴，中枢神经系统可以通过神经、免疫和内分泌等途径监控、调节肠道菌群的变化，肠道菌群也可以通过自身或代谢产物影响中枢神经系统[8-9]。研究表明肥胖人群的肠道菌群数量和多样性明显降低，引起消化道炎症的菌群占优势，使机体炎症因子的产生或免疫细胞的平衡发生变化[10-11]。分析粪便移植对铅暴露肥胖孕鼠子代肠道微生态及神经行为的影响，以期为铅暴露肥胖群体的健康防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3～4周龄SD大鼠，体质量180～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。该研究经过华北理工大学伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 建立实验动物模型

32只雌鼠随机分为对照组、铅暴露组、高脂组和高脂+铅暴露组，每组8只。对照组食用普通饲料和常规饮水，铅暴露组食用普通饲料、饮用含有500 mg·L-1醋酸铅的饮用水，高脂组食用高脂饲料和常规饮水，高脂+铅暴露组食用高脂饲料、饮用含有500 mg·L-1醋酸铅的饮用水。连续喂养6周，定期监测体重变化，建立肥胖母鼠模型。6周后按雌雄2∶1比例合笼，次日晨检查阴栓确定怀孕。孕17 d前每笼饲养3～4只，孕17 d分笼，每笼饲养孕鼠1只。分娩后母乳喂养，为防止哺乳数不同影响血脂，出生后3 d处死多余子鼠，使每窝子鼠为5只，雌雄各半，母乳喂养21 d。每日观察大鼠健康及活动情况，每周记录体重变化。

1.2.2 神经行为学测定

Morris水迷宫试验：PND60仔鼠经过3 d适应性学习后测定其学习记忆能力，记录第4天在平台120 s内逃逸潜伏时间。

1.2.3 粪便溶液的制备及粪便移植

无菌条件下留取对照组PND21仔鼠粪便，将粪便混合后称重，100 mg粪便溶解于50 mL无菌生理盐水，涡旋器搅拌混匀，22 μm滤网过滤，形成均一溶液，按照每日用量进行分装，冻存于-80 ℃冰箱。应用灌胃法将粪菌溶液移植给铅暴露组、高脂组、高脂+铅暴露组PND21仔鼠，隔日1次，灌胃15次后，分为对照组(Ctl60)、铅暴露组(Pb60)、高脂组(HF60)、高脂+铅暴露组(HF-Pb60)、铅暴露移植组(Pb60T)、高脂移植组(HF60T)、高脂+铅暴露移植组(HF-Pb60T)，并按以前各组饮食方式继续饲养至60 d(PND60)处死，无菌操作下收集孕鼠子代PND60大鼠粪便。

1.2.4 16S rRNA宏基因测序

对高通量测序的原始下机数据按照引物长度和Barcode信息获得的序列，进行可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)归并划分。根据OTU在不同样本中的丰度分布，分析每个样本的多样性水平以及各样本(组)在不同分类水平的组成；根据16S rRNA测序信息分析各组菌群在门、目、属水平的差异。

1.2.5 统计学方法

2 结 果

2.1 粪便移植对铅暴露肥胖孕鼠子代肠道菌群多样性的影响

2.1.1 孕鼠子代PND60大鼠肠道菌群α多样性分析

Chao1指数和Shannon指数分别反映微生物群的丰富度和均匀度，通过二者研究菌群Alpha多样性。与对照组比较，铅暴露组、铅暴露移植组、高脂移植组Chao1指数降低，高脂组、高脂+铅暴露组、高脂+铅暴露移植组Chao1指数升高，粪便移植能够显著改变铅暴露组、高脂组的Chao1指数(P<0.05)(图1 A)。与对照组比较，各组Shannon指数均有显著改变，粪便移植能够改变铅暴露组、高脂组的Shannon指数(图1 B)。结果表明粪便移植能够影响铅暴露肥胖孕鼠子代肠道菌群Alpha多样性。

注：A Chao1指数；B Shannon指数

2.1.2 孕鼠子代PND60大鼠肠道菌群β多样性分析

为进一步分析各组肠道微生物多样性的差异，采用OTUs信息构建加权的Unifrac距离矩阵，并且基于此进行主成分分析(principal composition analysis，PCA)。第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)分别解释了总变量的49.07%和25.00%。Weighted UniFrac结果Anosim=0.521、P=0.001(图2)，表明铅暴露导致孕鼠子代肠道菌群构成发生改变。

图2 孕鼠子代PND60大鼠肠道菌群主成分分析

2.2 粪便移植对铅暴露孕鼠子代肠道菌群构成及相对丰度的影响

2.2.1 孕鼠子代肠道菌群OUT分类及门水平菌群构成情况

孕鼠子代粪便经16S rRNA基因测序，OTUs最多可达652，最少为213(图3A)；门水平肠道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Protebacteria)、放射菌(Actinobateria)、变形菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)构成(图3B)。

注：Phylum(门)；Family(目)；Genus(属)；Species(种)。

注：厚壁菌门(Firmicutes)；拟杆菌门(Protebacteria)；放射菌(Actinobateria)；

2.2.2 粪便移植对孕鼠子代属水平肠道菌群相对丰度的影响

根据OTU丰度分布或样本间相似程度将PND60孕鼠子代肠道菌群各分类水平的群落组成加以聚类，在属水平上，对丰度前50位属进行聚类分析并绘制热图(图4),主要菌属包括Lactobacillus、Clostridium、Aggregatibacter、Pseudomonadac、Ruminococaceae、Osciilospira。与对照组比较，铅暴露组Lactobacillus、Pseudomonadac及铅暴露移植组、高脂组、高脂移植组、高脂+铅暴露组Ruminococaceae相对丰度显著提高(P<0.05)，各组Clostridium相对丰度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；移植前后Lactobacillus、Clostridium、Pseudomonadac、Ruminococaceae相对丰度有显著改变(P<0.05)，而Osciilospira仅在铅暴露组和铅暴露移植组间具有显著差异，铅暴露组、高脂+铅暴露组移植前后Aggregatibacter改变显著(P<0.05)(图5)。

注：与对照组比较 aP<0.05；各组移植后与移植前比较 bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05。

2.3 粪便移植对孕鼠子代大鼠神经行为的影响

PND60仔鼠经过3 d适应性学习后测定其学习记忆能力，记录第4天在平台120 s内逃逸潜伏时间，结果显示，相较于对照组，铅暴露组、高脂组、高脂铅暴露组逃逸潜伏时间延长(P<0.05)，铅暴露移植组、高脂移植组、高脂铅暴露移植组较移植前发生改变(P<0.05)(图6)。

注：与对照组比较 aP<0.05；各组移植后与移植前比较 bP<0.05，cP<0.05，dP<0.05。

3 讨 论

铅作为一种神经毒物，广泛存在于人们的生产和生活环境中，长期慢性铅暴露可导致胃肠道症状以及肠道菌群的改变[12]。

本研究结果显示粪便移植能够改变铅暴露组、高脂组Chao1及Shannon指数，影响铅暴露肥胖孕鼠子代肠道菌群多样性。孕鼠子代门水平肠道菌群主要包括厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Protebacteria)、放射菌(Actinobateria)、变形菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)，主要菌属包括Lactobacillus、Clostridium、Aggregatibacter、Pseudomonadac、Ruminococaceae、Osciilospira；铅暴露组Lactobacillus、Pseudomonadac菌群相对丰度升高，粪便移植后Lactobacillus、Pseudomonadac、Aggregatibacter相对丰度降低，而Clostridium、Osciilospira、Ruminococaceae相对丰度升高；高脂组在粪便移植后，Lactobacillus、Pseudomonadac相对丰度降低，而Clostridium、Ruminococaceae相对丰度升高；高脂加铅暴露组在粪便移植后Lactobacillus、Pseudomonadac、Aggregatibacter相对丰度增加，而Clostridium、Ruminococaceae相对丰度降低，提示铅暴露肥胖孕鼠子代存在肠道菌群紊乱，粪便移植有利于改善子代菌群构成。

肠道菌群的早期发育受到多种因素影响，包括喂养方式、生活环境、抗生素、母亲菌群等。Schultz等[13]研究显示妊娠期母亲服用益生菌，在出生后24个月的婴儿粪便样本中能够检测到；Gueimonde等[14]研究显示妊娠期母亲服用鼠李糖乳杆菌影响婴儿肠道双歧杆菌的定植，上述研究表明母代菌群结构能够影响子代菌群结构。基于微生物-肠-脑轴的双向调节，肠道菌群的改变也会影响神经行为[15]，本研究中将正常大鼠粪便移植到铅暴露组、高脂组、高脂铅暴露组，Morris试验证实粪便移植后各组神经行为发生改变。

综上，探讨粪便移植对铅暴露肥胖孕鼠子代肠道微生态的影响，可为铅暴露肥胖群体的健康防治提供新思路。