银耳孢子凝固型酸奶制备工艺

朱涵予，陈政

（衡阳师范学院 生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421000）

银耳是一类具有保健功能的食用菌，富含多糖、蛋白质、黄酮类和多种维生素等营养物质，具有极高的食用、药用及经济价值[1]。银耳孢子较银耳子实体相比有生长周期短、易培养、耐贮存等优势[2]。银耳孢子发酵液中的孢子多糖含量是银耳子实体的7～8倍，且与银耳多糖的结构相似，功能相近，具有增强肠道消化能力、降低血脂、抗衰老与抗氧化、降低血糖等功效[3-4]。目前已有以多种银耳子实体为原料的食品得到开发，如银耳酸奶[5-6]、银耳露酒[7]、银耳豆奶[8]，而对银耳孢子相关的应用较少。

酸奶是一类以牛奶为主要原料，经乳酸菌发酵而成的一类富含多种营养物质、芳香物质的饮品，在调节肠道环境、提供营养以及促进人体健康等方面都起着重要的作用[9]。目前我国所研发的酸奶功能和种类都较单一[10]，且银耳相关酸奶产品主要以银耳子实体为原料[6]，银耳孢子酸奶在市场上还未有产品。因此，本课题将银耳孢子作为原料添加入牛奶，经保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵制成银耳孢子酸奶，并从银耳孢子添加量、蔗糖添加量、乳酸菌发酵剂接种量、发酵等方面探究银耳孢子酸奶的最佳制作工艺，为酸奶口味多样化和实际生产提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

银耳孢子菌种：Y13，保存于华中农业大学食品科学微生物实验室；全脂奶粉、脱脂奶粉：内蒙古伊利实业集团股份有限公司；白砂糖：长沙市湘特食品有限公司；保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌：丹尼斯克（中国）公司；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯葡萄糖(PDB)培养基、MRS培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；淀粉酶（酶活力≥1.5 U·mg－1）：河南万邦有限公司；氯化钠、氨水、无水乙醇、无水乙醚、石油醚、刚果红、盐酸、碘、氢氧化钠、乙醚、七水硫酸钴、酚酞、三氯甲烷、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、对硝基苯酚、乙酸钠、无水乙酸钠、乙酸、甲醛、乙酰丙酮：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器

SW-CJ-ID型单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；THZ-C-1冷冻恒温振荡仪：太仓市实验设备厂；MJX-280型恒温培养箱：金坛市安普实验仪器厂；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司；DHG-9240型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；C21-WK2102型多功能电磁炉：上海一恒科学仪器有限公司；722S型可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；AN168型电子天平：上海民桥精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程

银耳孢子发酵液→水、全脂乳粉、蔗糖混合灭菌冷却接种灌装发酵→后熟成品

操作要点

（1）银耳孢子培养：保存的银耳芽孢菌种接种至PDA培养基上培养3 d，挑取活化的银耳孢子接入PDB培养基中，25℃，115 r·min－1摇床培养4 d得到银耳孢子发酵液。待摇床培养完成后用血球计数板计数并稀释至1×108CFU·mL－1，并置于121℃灭菌15 min，于4℃冰箱中冷藏备用。

（2）酸奶制作：将水倒入锅中煮沸，加入全脂奶粉和白砂糖混合，向牛乳中加入银耳孢子发酵液混匀并用纱布进行过滤，再次加热至95℃，维持10 min。待混合液冷却至42℃左右，接入乳酸菌发酵剂，搅拌均匀后灌装到已灭菌酸奶玻璃瓶中，于42℃恒温培养箱发酵至成熟，放入4℃后熟。

1.2.2 实验设计

（1）单因素实验

①银耳孢子添加量的确定：在蔗糖添加量6%，发酵剂接种量0.1%，发酵温度42℃，发酵时间9 h的条件下，将样品分成5组，其中每组3个平行试验。改变银耳孢子的添加量，在5组样品中分别添加8%，12%，16%，20%，24%的银耳孢子，研究银耳孢子添加量对银耳孢子酸奶感官品质的影响。

②发酵剂接种量的确定：在蔗糖添加量6%，银耳孢子添加量16%，发酵温度42℃，发酵时间9 h的条件下，将样品分5组，其中每组3个平行试验。改变发酵剂接种量，在5组样品中分别添加0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%的乳酸菌发酵剂，研究发酵剂接种量对银耳孢子酸奶感官品质的影响。

③蔗糖添加量的确定：在银耳孢子添加量16%，发酵剂接种量0.1%，发酵温度42℃，发酵时间9 h的条件下，将样品分成5组，其中每组3个平行试验。改变糖添加量，在5组样品中分别添加5%，6%，7%，8%，9%的蔗糖，研究蔗糖添加量对银耳孢子酸奶品质的影响。

④发酵时间的确定：在蔗糖添加量6%，银耳孢子添加量16%，发酵剂接种量0.1%，发酵温度42℃的条件下，将样品分5组，其中每组3个平行试验。改变发酵时间，5组样品的发酵时间分别是8，9，10，11，12 h，研究发酵时间对银耳孢子酸奶品质的影响。

（2）正交试验设计

根据单因素试验结果，将温度控制在42℃，以银耳孢子添加量、乳酸菌发酵剂接种量、蔗糖添加量、发酵时间作为影响银耳孢子酸奶品质的主要因素。在每个因素中分别选出3个较好的水平进行正交试验中。

1.2.3 质量评价

（1）感官评定标准

请10位具有相关经验的感官评定员从色泽、气味、滋味、组织状态、凝乳状态5个方面对银耳孢子酸奶成品进行感官分析。所得结果为每项分值之和，感官评定标准如表1，感官评定表满分为100分。

表1 感官评定标准

（2）酸奶质量指标的测定方法

①脂肪含量测定

采用索氏抽提法测定酸奶中脂肪含量。取充分混匀酸奶样品10 g于抽脂瓶中，加入质量分数为25%氨水2 mL，混匀后置于65℃的水浴中加热15 min。取出冷却至室温，期间不时取出振荡。用乙醚提取酸奶样品中的脂肪后，置于沸水浴蒸发去除乙醚，直至恒重并称重。每组计数3次，取平均值。

②蛋白质含量测定

依次精密吸取0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL氨氮标准使用溶液，分别置于10 mL比色管中。各加入乙酸钠-乙酸缓冲溶液4 mL及显色剂4 mL，加水稀释至刻度，混匀，置于100℃水浴中加热15 min。取出冷却至室温。将第一瓶作为空白对照，在400 nm波长处测其吸光度值。以酸奶质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。取1 g酸奶样品按照以上方法测定吸光值，重复3次取平均值。

③酸度测定

准确称取4 g酸奶样品于250 mL锥形瓶中，加入96 mL蒸馏水使酸奶样品溶解，搅拌，静置20 min。以酚酞作为指示剂，用0.1 mol·L-1NaOH溶液滴定，直至5 s内颜色不消退，整个滴定过程应在45 s内完成。每组计数3次，取平均值。

④乳酸菌计数

称取酸奶样品25 g，置于无菌均质杯中，加入无菌生理盐水225 mL，振摇混匀并进行梯度稀释，选择2~3个适宜的稀释度，各取匀液1 mL加入到无菌培养皿内，涂布至MRS培养基，于37℃培养1~2 d。每组计数3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 银耳孢子添加量对酸奶感官评定的影响

在酸奶中添加银耳孢子，增加酸奶的营养价值的同时也影响着酸奶的风味和组织状态，对酸奶的品质有着重要的影响。银耳孢子的添加量对酸奶感官评定的影响如表2。从表2中可以看出，酸奶的感官品质呈先上升后下降的趋势，随着银耳孢子添加量的增加，银耳的风味越来越浓郁。当银耳孢子添加量为16%时，酸奶的感官评分达86分，感官品质最好，银耳的风味较适宜，具有较明显的银耳清香味，且组织结构和凝固状态都较好，表面均匀、光滑，无明显的乳清析出。当银耳添加量为8%时，感官评分较低，银耳的风味较淡，几乎尝不出银耳滋味，但奶味较浓，组织状态较好。当银耳添加量为12%时，可以尝出少许银耳滋味，但口感和气味都不如银耳孢子添加量为16%的酸奶好，此时银耳孢子酸奶的感官评分为82分。而银耳孢子添加量为20%时，银耳味较浓，且组织状态和凝固状态都略逊于银耳孢子添加量为16%的酸奶。当银耳孢子添加量为24%时，银耳孢子酸奶的感官评分低至78.3分，此时酸奶的银耳滋味过浓，风味较差，且组织松散，凝固性差。

表2 不同银耳孢子添加量对酸奶感官评定的影响

2.2 发酵剂接种量对酸奶感官评价的影响

发酵剂接种量在一定程度上影响着酸奶的品质。过大的接种量可能会导致发酵过快，使成品酸味过重，且可能会使乳清析出，使酸奶凝固性和组织状态较差，所以接种量对酸奶的品质有重要影响。不同的接种量对酸奶的影响见表3。从表3中可以看出，当接种量为0.05%时，酸奶的凝固性和组织状态都较差，风味较淡。当接种量为0.25%时，酸奶的凝固性和组织状态都较差，滋味过酸，且有少量的乳清析出。当接种量在0.1%~0.2%之间时，酸奶的风味、组织状态和凝固性都较好。其中接种量为0.1%时，酸奶的感官品质达到最佳，感官评分高达90.3分。

表3 不同发酵剂接种量对酸奶感官评价的影响

2.3 蔗糖添加量对酸奶感官评价的影响

不同的蔗糖添加量对酸奶感官评定的影响如表4所示。从表4中可以看出，当蔗糖的添加量未超过8%时，酸奶的感官品质差别不大。当蔗糖的添加量达到9%时，酸奶的感官评分为80.5分，酸奶的感官品质下降明显。蔗糖的添加量为5%时，银耳孢子酸奶的气味较淡，口感较差。当添加量为6%时，酸奶偏酸。7%的蔗糖添加量，酸奶的感官评分达89.1分，酸甜比较适宜，口感较好。蔗糖的添加量为8%时，酸奶偏甜，口感较好。蔗糖的添加量为9%时，甜味过重，口感和组织状态都较差。

表4 不同蔗糖添加量对酸奶感官评价的影响

2.4 发酵时间对酸奶感官评价的影响

发酵时间的长短对酸奶感官评定的影响如表5所示，随着发酵时间的延长，酸奶的感官品质呈先上升后下降的趋势。其中发酵9 h的酸奶，酸奶的感官评分达86分，此时的酸奶凝固性较好，无乳清析出且滋味酸甜适宜。当发酵时间为8 h时，发酵时间较短，风味较淡，凝乳状态较差，但无明显的乳清析出。当发酵时间达到12 h时，酸奶的感官评分低至76.3分，发酵时间过长，酸乳滋味过浓，且乳清析出严重，感官品质较差。

表5 不同发酵时间对酸奶感官评价的影响

2.5 正交试验

为了更好确定银耳孢子酸奶的最佳制作工艺，本实验采用正交试验的方法。选择银耳孢子发酵液添加量、发酵剂接种量、蔗糖添加量、发酵时间4个因素作为影响因素。根据单因素试验，从各因素中选出3个较好的水平做正交试验。三因素三水平正交试验见表6。

表6 正交试验的因素和水平

根据以上选定的因素和水平进行L9(34)正交试验，结果如表7所示。从表7中可以得出银耳孢子酸奶的最佳制作工艺为A2B2C3D1，根据极差值R得出各影响因素的影响顺序应为A＞C＞D＞B，即银耳孢子发酵液添加量＞蔗糖的添加量＞发酵时间＞发酵剂接种量。由此可见银耳孢子的添加量对酸奶感官品质的影响最大，其次是糖的添加量。发酵剂的接种量和发酵时间的长短相对来说对酸奶的感官品质影响较小。因此可以确定银耳孢子酸奶的最佳工艺条件为在发酵温度为42℃的条件下，添加8%的蔗糖，16%的银耳孢子，接入0.15%的乳酸菌发酵剂，经9 h发酵制成的银耳孢子酸奶感官品质最佳。

表7 L 9(34)正交试验数据

2.6 酸奶质量指标

我们根据正交试验结果所得的最佳工艺进行酸奶的制备，并进行酸奶相关质量指标的测定。测得的银耳孢子酸奶的脂肪含量为2.7 g·100 g－1；蛋白质含量为2.45 g·100 g－1；酸度为79°T；乳酸菌数为3.49×107CFU·g-1。根据GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》中所规定的标准，要求脂肪含量为≥2.5 g·100 g－1，蛋白质含量≥2.3 g·100 g－1，酸度≥70.0°T，乳酸菌数≥1×106CFU·g－1。上述结果显示，银耳孢子酸奶的各项理化指标及微生物指标均符合GB 19302—2010规定的要求[9]，为合格的产品（见表8）。

表8 理化指标与微生物指标

3 结论

本实验以银耳孢子和牛奶为原料，选用嗜热乳酸链球菌和保加利亚乳杆菌1:1混合菌种作为乳酸菌发酵剂。实验通过单因素试验对影响酸奶品质的4个主要因素：银耳孢子的添加量、蔗糖添加量、发酵剂接种量、发酵时间进行了探究。

（1）在研究不同银耳孢子添加量对银耳孢子酸奶感官评定的影响时，得出当银耳孢子添加量为16%时酸奶的感官品质最佳。银耳添加量为8%和12%时，银耳的风味较淡，而银耳孢子添加量为20%和24%时，银耳味都较浓，口感和气味都不如银耳孢子添加量为16%的酸奶。

（2）在研究不同的发酵剂接种量对酸奶感官评价的影响时发现，当接种量在0.1%~0.2%之间时，酸奶的风味、组织状态和凝固性都较好。其中接种量为0.1%时，酸奶的感官品质达到最佳。当接种量为0.05%和0.25%时，酸奶的组织状态和凝固性都较差。

（3）在研究不同蔗糖添加量对酸奶感官评价的影响时发现，当蔗糖的添加量未超过8%时，酸奶的感官品质差别不大。当蔗糖的添加量达到9%时，酸奶的感官品质下降明显。蔗糖的添加量为5%时，银耳孢子酸奶的气味较淡，口感较差。当添加量为6%时，酸奶偏酸，口感一般。7%的蔗糖添加量，酸甜比较适宜，口感较好。蔗糖的添加量为8%时，酸奶偏甜，口感较好。蔗糖的添加量为9%时，甜味过重，口感和组织状态都较差。

（4）在研究发酵时间的长短对酸奶感官评价的影响时发现，发酵9 h的酸奶，凝固性较好，且无乳清析出，滋味酸甜适宜。当发酵时间为8 h时，因发酵时间较短，风味较淡，凝乳状态较差，但无明显的乳清析出。当发酵时间达到12 h时，发酵时间过长，酸乳滋味过浓，且乳清析出严重，感官品质较差。

（5）本实验通过正交试验确定了银耳孢子酸奶的最佳制作工艺，研究表明当糖添加量为8%，银耳孢子添加量为16%，发酵剂接种量为0.15%，发酵温度为42℃，发酵时间为9 h时，银耳孢子酸奶的感官品质最佳。且经检测，银耳孢子酸奶的脂肪含量为2.7 g·100 g-1；蛋白质含量为2.45 g·100 g-1；酸度79°T；乳酸菌数达到3.49×107CFU·g-1，均符合国家标准。银耳孢子酸奶同时具有银耳和酸奶的营养和保健功能，银耳和牛乳达到营养互补，提高了产品的营养价值[11]。本实验为银耳孢子风味酸奶的研制提供了理论依据，丰富了功能性酸奶的种类，具有较好的市场前景。