川西高山树线交错带海拔梯度上土壤不同组分氮特征

杨济源，秦纪洪

（1.四川大学建筑与环境学院，成都 610065；2.成都大学建筑与土木工程学院，成都 610106））

氮素是陆地生态系统元素循环中重要组成部分，同时也是植物生长发育必需的营养物质，是评估当前和未来森林生产力的关键[1]。高海拔土壤储存着大量的氮（N），有机氮和无机氮是森林土壤氮库中两种主要存在形式，其中有机氮含量占到了93%以上[2]。海拔的变化造成了温度、湿度和太阳辐射等非生物因素的梯度，这些因素反过来影响森林组成和土壤有机氮[3]。川西高原由于陡峭的海拔梯度，在短距离内具有不同的森林类型进而形成自森林线（郁闭森林分布上限）到乔木线（乔木分布上限），介于亚高山针叶林与高山乔灌之间的高山树线群落交错带（alpinetreeline ecotone，ATE）。ATE常年处于氮限制状态和低温阈值，应对全球变化响应敏感，这使其氮过程更容易受到气候扰动且比在低海拔地区更为迅速和严重[4]。

土壤池可以被分离为微生物可获得的颗粒态有机质（particulate organic matter，POM）和矿物保护和微生物不可获得的矿物伴生有机质（mineral-associated organic matter，MAOM）[5]。一般来说，POM 中的有机氮（particulate organic nitrogen，PON）是不稳定的、快速周转的氮，被认为是土壤中氮的“活性”来源[6]。有研究表明，受海拔升高的影响会分别导致土壤有机氮含量分别表现为降低[7]、单峰增加[8]和增加[9]的情况，在高海拔地区多表现为增加[10-11]。Tan W.等[12]研究发现，气候变化会不同程度上影响土壤团聚体有机质的转化，影响强度随土壤粒径变化。总的来说，气候变化对土壤有机氮的影响很大程度上依赖于土壤团聚体的理化性质。但是鲜有研究表明哪一组分土壤团聚体对有机氮含量变化贡献较大[13]。MAOM通过与矿物的关联来稳定氮素形成矿物态有机氮（mineral-associated organic nitrogen，MAON），矿物相关组分积累会使丢失氮的速度变慢，所以矿物结合态土壤组分间的转化以及各组分有机质的矿化是土壤有机质循环的重要环节[14]。以前MAOM因其稳定性被普遍认为其转化是一种长期过程。然而，近期证据表明，除对短期响应最显著的POM之外，MAOM也能对土壤扰动的变化做出响应，也会对植物和微生物的氮动态产生影响[15]。MAOM中不同氮组分活性不同，其组成会影响氮稳定性，深入认识土壤氮活性特征对预测全球变化背景下土壤环境效应是必要的。目前多采用物理[16]、化学或物理-化学法[17]针对土壤氮不同活性组分进行分级。目前有关氮动态的研究集中在人工生态系统和低海拔生态系统，而针对全球变化背景下高寒土壤生态系统氮空间分布特征的相关研究工作并不多，且对于ATE动态变化对高寒生态系统和MAON的相关研究更为缺乏。高寒土壤氮组成因海拔导致环境因子变化的影响而分异，因此，本研究旨在利用土壤物理-化学分级的方法，揭示ATE海拔梯度对土壤团聚体结构、矿物结合态氮及其分配的影响，以期为深入探究矿物结合态有机质矿化的差异和相互关系提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 研究区自然概况

研究区地处四川省阿坝藏族羌族自治州梦笔山西南坡玛嘉沟，由大雪山和邛崃山系交界北部地段多个高峰组成，海拔均达4 000 m以上，土壤从下至上分别为山地棕色针叶林土及高寒草甸土。川西（青藏高原东缘和横断山区）高山树线（ATE）一般介于海拔3 800～4 200 m，在较小海拔梯度范围内生态环境有极大变化，随海拔高度升高，植被的类型以及微气候均会随之剧烈变化。该区域气候属于高寒气候，年降水量600～1 100 mm，涵盖了从针叶林到高山灌丛，高山草甸等各种植被类型。建群种主要为暗针叶林如岷江冷杉（Abies faxoniana）和紫果云杉（Picea balfouriana）为主的；除乔木外，林下及林窗有细枝茶 藨 子四川忍冬（Loniceras zechuanica）、多个种杜鹃花（Rhododendron spp.）和柳属几个种（Salix spp.）等灌木植物在其中零星分布。草甸植被类型为莎草类+禾草类+双子叶杂草类群系，莎草类主要以线叶嵩草（Kobresia capillifolia）为主；禾草类植物主要有冷地早熟禾（Poa poophagorum）和草地早熟禾（Poa pratensis）等；双子叶杂草类植物中常见的有毛茛科的钝裂银莲花（Anemone obtusiloba）、条叶银莲花（Anemone trullifolia）等。

按海拔自下而上可分为3条分界线：ATE下沿，ATE中部，ATE上沿。高山树线交错带由从ATE下沿到ATE上沿之间的整个过渡区构成。

于2018年11月上旬在研究区域内选择具有代表性的典型针叶林-灌丛-草甸交错带，此时高寒气候特征明显且尚无雪被覆盖。调查访问不同海拔的植被类型等基本概况。采用平行样带法收集土壤层样品，平行于等高线从低海拔至高海拔依次经针叶林上沿（海拔（3 900±50）m）、杜鹃灌丛（海拔（4 080±60）m）和草甸（海拔（4 200±50）m）分别设置一条宽20 m的平行样带。在每一植被类型的平行样带内设置3个样方作为重复，样方面积为20 m×20 m。在每个样方上按蛇形采样法选取10～15个土壤采样点，将0～20 cm土样用铁铲小心铲出并混匀成1个土样，小心剔除石砾、根系及其他杂质后装入无菌牛皮袋中作为一个土壤样本。土壤经冷藏运输回实验室后风干，过2 mm筛后尽快分析。各研究点地理特征和植被情况详情见表1。

表1 高寒土壤样品采集位点地理特征和植被群落类型Table 1 Geographical characteristics and vegetation community types of alpine soil sample collection sites

1.2 土壤氮组分分级及样品测定

分别采用物理和化学试剂连续提取方法对土壤进行不同氮组分分级和测定[18]。物理分级将不同粒级土壤分开，每个化学分级步骤提取1个氮组分并测定相应组分含量。

物理分级：利用超声波分散后将过筛后的ATE土壤样品采用湿筛法分离成不同的粒级。f1表示被筛分成0.25～2 mm的组分，f2表示0.05～0.25 mm的组分，f3表示 0.02～0.05 mm 的组分，f4为＜0.02 mm粒级的土壤组分。粒径＞0.05 mm的土壤颗粒中的有机氮被定义为PON[6]，＜0.02 mm的土壤被用于进行化学分级提取各级矿物结合态氮组分[18]。

化学分级：提取容器均采用塑料容器，每步骤提取均加入65 mL提取液，必要时调节pH。第一次震荡浸提16 h，第二次震荡浸提1 h，转速160 r/min；分离采用3 300 g加速度离心15 min；

①称取2 g粒径小于0.02 mm的f4粒级土壤组分放入烧杯，加入超纯水200 mL和饱和KAl（SO4）2溶液3 mL并静止2 d待其沉淀，取上清液，剩下部分再次离心后取上清液，2次得到的上清液混合得组分N1。沉淀为矿物结合态有机质。

②在上步二次离心后所得的沉淀中加入0.5 mol/L的K2SO430 mL，震荡浸提后离心，取出上清液，余下部分加入40 mL K2SO4，震荡浸提后离心，再次取上清液经混合后得组分N2。

③在上步二次离心所得的沉淀中加入0.1 mol/L，pH=9.7的40 mL Na2B4O7，震荡浸提离心后取出上清液，剩下部分加入浸提液后再次离心后取上清液，再次取上清液经混合后得组分N3。

④在上步二次离心所得的沉淀中加入pH=10.2的0.1 mol/L 40 mL Na2P2O7，取离心后上清液，剩下部分加入浸提液后再次离心后取上清液，再次取上清液经混合后得组分N4。

⑤在上步二次离心所得的沉淀中加入0.1 mol/L40 mL的NaOH，震荡浸提离心后取出上清液，余下部分加入40 mL上述提取液再次震荡浸提离心，将2次取出的上清液混合，得组分N5。

⑥在上步二次离心所得的沉淀中加入5 mL 0.33 mol/L冷H2SO4酸化处理10 min至pH=1.5，再加入40 mL 0.1 mol/LNaOH溶液，取出离心后上清液，余下部分加入40 mL 0.1 mol/L NaOH后再次震荡浸提离心，取上清液。将两次提取后的上清液混合，得组分N6。

⑦在上步二次离心所得的沉淀中加入pH=8的0.1 mol/L 20 mL Na2S2O4溶液处理静置10 min，再次加入0.1 mol/L 20 mL的NaOH溶液，震荡浸提离心后取出上清液，余下部分再次加入40 mL 0.1 mol/L NaOH溶液后取离心上清液，将2次取得的上清液混合，得到组分N7。在沉淀中加入40 mL超纯水浸提1h后离心，除去离心后上清液，洗去残存的Na2S2O4。

⑧在上一步洗去残存Na2S2O4的沉淀中加入20mL 8 mol/L的HF静置处理10 min，加入20 mL 0.1 mol/L NaOH震荡浸提，取离心后的上清液，余下的沉淀再次加入40 mL 0.1 mol/L的NaOH经过震荡浸提离心后将上清液取出，将2次离心得到的上清液经混合后用0.1 mol/L NaOH中和，得到组分N8。剩下的沉淀再次加入40 mL超纯水震荡浸提1 h后离心去掉上清液，去除残留HF。

⑨余下不溶组分，为组分N9，稳定性很强的胡敏素（腐殖质）氮。

上述提取液中的氮含量采用TOC/TN分析仪（型号Milti N/C 2100S，德国Jena）分析测定；最后的不溶组分样品中的氮含量采用元素分析仪（型号Vario EL/micro cube，德国 elementar）分析测定。

1.3 数据分析

数据统计分析采用SPSS 25.0软件进行单因子方差分析（ANOVA）和邓肯式多重比较（Duncans multiple test）用于不同海拔下土壤氮素含量的差异显著性检验（P=0.05）；

2 结果与分析

2.1 高山树线交错带土壤粒级分布特征及有机氮含量

由图1可以看出，对于同一海拔高度不同粒级，土壤质量百分比随粒级减小显著降低。f3和f4粒级颗粒物的质量占比很低，而f1和f2的质量占比则显著高于f3及f4粒级的土壤，f1粒级土壤质量略高于f2粒级土壤的占比，f3粒级土壤质量略高于f4粒级土壤质量占比。

对比不同海拔高度同一粒级土壤质量的百分比，f1粒级土壤质量百分比的趋势表现为ATE下沿＞ATE上沿＞ATE中部；f2及f3粒级土壤质量百分比的总体趋势表现相近，ATE中部＞ATE上沿＞ATE下沿；f4粒级土壤质量百分比的在各海拔梯度上无显著差异。

图1 高山树线交错带不同粒级土壤质量百分比及有机氮含量Figure 1 Percentage by weight and organic nitrogen content of soil with different grain sizes in alpine treeline ecotone

在所有粒级中，土壤含氮量均很高，其中在树线上沿f2粒级土壤最高，含氮量达到了9.663 g/kg；ATE下沿f4粒级的土壤最低，含氮量为3.107 g/kg。f1和f2粒级显著高于f3和f4粒级土壤氮含量。

对比同一海拔不同粒级，氮含量均表现为f2＞f1＞f3＞f4，除ATE下沿外，f2相较于f1降低幅度不大，f3相较于f2下降显著，f4相较于f3下降也比较显著。ATE上沿和ATE中部土壤氮含量随粒级变化影响显著，而ATE下沿土壤氮含量相对比较稳定。对比同一粒级不同海拔土壤氮含量变化趋势总体表现为随着海拔的升高而升高。对于f1和f2粒级土壤，ATE下沿氮含量与ATE中部和ATE上沿差异显著，ATE上沿和ATE中部氮含量差异不显著。对于f3和f4粒级土壤，氮含量随海拔升高而升高显著升高。

2.2 高山树线交错带土壤氮化学分级特征

从图2可以看出，高山树线交错带上土壤氮组分的含量最高不超过1%，表明矿物结合态氮的含量在土壤中的含量极低。除N1，N3，N4和N6组分氮含量在海拔梯度上无显著性差异之外，其他组分氮的含量在海拔梯度上都呈现显著性差异。氮组分主要以NF3、NF5、NF9的形式存在，而活性相对较高的N1和N2含量却很低，仅占总提取氮组分的4.76%。对于N3，N5和N7组分，不同组分氮含量表现出相同的变化趋势随着海拔的升高而升高；对于N1，N2，N6和N8组分，氮含量随海拔上升先升高后降低。对于N4和N9组分，N4组分表现为ATE下沿＞ATE上沿＞ATE中部，N9组分表现为ATE上沿＞ATE中部＞ATE下沿。

图2 高山树线交错带土壤矿物结合态氮组分含量Figure 2 Content of mineral-associated nitrogen components in the alpine treeline ecotone

2.3 高山树线交错带土壤氮的稳定性

在连续提取矿物结合态氮组分过程中，稳定性越高的组分越难提取。PON相比于MAON活性更高，POM所占的比例越大说明该土壤氮活性越高[19]；在矿物结合态氮中组分N1～N9的稳定性依次升高。

由表2可知，对于川西ATE区域海拔梯度土壤有机氮，PON占比极大，均占到了94%以上，远高于其他生态系统PON比例[20-21]。其中粒径0.25～2.00 mm的有机氮含量占比在ATE下沿处显著高于ATE上沿和中部，粒径0.05～0.25 mm及0.02～0.05 mm有机氮含量则显著低于ATE上沿和中部。粒径＜0.02 mm的有机氮含量和MAON占比均极低，在海拔梯度上差异不显著。

表2 各组分氮含量在总有机氮中的占比Table 2 Proportion of organic nitrogen in total organic nitrogen %

由表3可知，其中稳定性最高的组分N9的占比最高，占总提取氮20.7%～28.71%，占比最大的位置为ATE下沿，达到了28.71%；活性最高的组分水溶性有机氮N1和可溶性有机氮N2的占比很低，N1占矿物结合态氮中的 3.72%～4.55%，N2占1.80%～2.55%，随海拔升高而下降，表现为ATE下沿＞ATE中部＞ATE上沿；虽然MAON中活性最低的胡敏素氮N9含量很高，但N1～N9占总有机氮的比例均极低。

表3 各化学分级氮组分含量在矿物结合态氮中的占比Table 3 Proportion of nitrogen content for mineral-associated nitrogen with different chemical grades %

3 讨论

森林土壤有机氮库在参与生物地球化学循环和反馈全球气候变化中起着十分重要的作用。ATE作为承受环境变化压力最大的高寒生态系统之一，揭示青藏高原东缘川西ATE表层土壤有机氮特征有助于认识青藏高原高寒区域土壤氮循环过程[22]。本研究利用物理-化学联合分离方法将不同活性的氮组分尽可能分离开来，以此来量化不同组分氮含量。相较于仅研究总氮储量而言，更有利于进一步探究气候变化对土壤氮过程的影响机制。

PON被认为是土壤中氮的“活性”来源，与MAON，它们更容易被分解者获取[20]，对氮的矿化和周转有显著的贡献。由刘志祥等研究显示，在温带土壤中PON含量约占土壤总氮的50%左右[6]。本研究表明，ATE土壤颗粒组成主要是以粗颗粒形式存在，有机氮存在形式以活性高的PON为主，占总有机氮的94%以上，MAON占比不足2%，比例远低于一般土壤[18]。MAON中各化学分级组分在海拔梯度上差异均不显著，表明MAON对环境变化响应较弱。“microbial filter”假说指出，容易分解的高质量凋落物优先被微生物同化，微生物同化物随后被矿物表面所吸收进而形成MAON，而含有更多结构木质素成分的低质量凋落叶中的氮在土壤中作为PON积累[23]，川西高寒土壤地被物质量低，微生物活性低时造成氮素以PON为主，MAON含量占比极低的主要原因[23-24]。

海拔高度显著影响ATE土壤有机氮含量。PON在ATE下沿处显著高于ATE上沿和中部。川西高原由于陡峭的海拔梯度，在短距离内具有不同的森林类型和微气候。研究表明，森林群落结构和水热因子是驱动森林氮变化的主要原因[9，11，25]。ATE 下沿针叶凋落物质量低，土壤含水量低，使得PON不易转化为水溶性氮而在总有机氮中以相较于ATE上沿和中部占比更高[9]。与PON不同，MAON含量及各化学分级氮组分比例在海拔梯度上差异不显著，说明MAON对于气候变化的响应具有一定的稳定性。

在MAON中活性最高的水溶性和可溶性有机氮含量占比最低，可能是因为活性氮组分主要存在于PON中。除胡敏素氮外，分别用Na2B4O7、Na4P2O7和NaOH提取的矿物弱固持有机氮、阳离子固持有机氮和强连接有机氮的含量占比最大，与S.Prieto等的研究结果类似[26]。其中弱固持有机氮含量最高，表明MAON以弱离子结合为主，容易矿化。强连接有机氮含量显著低于ATE上沿和中部，可能是因为ATE下沿氮素主要集中在胡敏素中。M.Gocke等[27]研究发现，碳酸盐涂层覆盖在土壤团聚体上，对土壤有一定的保护作用。其主要存在于石灰土壤中，因此在川西高寒土壤中碳酸盐闭蓄有机氮含量较低。铁氧化物氮随海拔升高显著升高，S.Turner等[28]研究表明铁氧化物的含量主要受pH的影响。HF溶液可以破坏土壤中的硅酸盐，硅酸盐中可能包含着之前无法被提取的强固持有机氮[29]。在HF提取后的溶液中，强固持有机氮含量均较低且在海拔梯度上表现出显著差异，这主要与海拔高度导致的硅酸盐含量差异有关[18]。ATE中部胡敏素氮在MAON中所占的比例显著低于ATE上沿和下沿，ATE中部地被物较ATE下沿少且比ATE上沿受到的低温限制弱，导致稳定性氮积累较少，在MAON中占比低[28]。但胡敏素氮在总有机氮中占比仅为0.27%～0.41%，表明腐殖化并非川西高海拔土壤主要氮过程。

4 结论

ATE物理分级土壤有机氮主要集中在不稳定的粗颗粒土壤中（≥0.05 mm），存在形式主要为PON，占总有机氮的94.08%以上，显示川西土壤有机氮库活性高。粒级为0.05～0.25 mm的土壤有机氮含量最高，粒级＜0.02 mm的土壤最低。随着海拔升高土壤有机氮含量显著增加。MAON占比不足总有机氮的1.47%，土壤MAON的主要存在形式是以矿物弱固持有机氮、阳离子固持有机氮、强连接有机氮及胡敏素氮为主。除可溶性有机氮、阳离子固持有机氮以及土壤矿物强固持有机氮，其余矿物结合态氮组分在MAON中的占比对海拔梯度变化均无显著响应，所有矿物结合态氮组分在总有机氮中占比均不受海拔梯度显著影响。胡敏素氮占总有机氮比例极低，显示高寒土壤因氮库活性高而受海拔梯度影响显著，矿物结合及腐殖化均非高寒土壤主要过程。受全球变化的影响，随着海拔降低（气温升高），ATE土壤氮的矿化速率将加快，土壤不稳定性组分降低，有机氮总量下降，稳定性上升。