姜黄素缓解毒死蜱对大口黑鲈氧化胁迫的分子机制

赵柳兰，唐 钢，熊 陈，韩帅帅，杨春平，罗 伟，李志琼，杨 淞*

（1.四川农业大学动物科技学院，成都 611130；2.四川农业大学农学院，成都 611130）

水体径流中农药引起的水污染问题受到广泛关注[1]，特别是广谱有机磷农药的使用。毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）是最普遍的有机磷农药之一，在水稻、小麦、大豆和棉花等大田作物的病虫害防治中经常使用，被世界卫生组织列为Ⅱ类中度危害农药[2]。施用后，其可以通过径流、河流、水渠、池塘等水域途径进入养殖水体[3]。除了对农业水体本身造成残留污染外，毒死蜱对污染水域内的鱼类也表现出高度毒性[4]。大口黑鲈是我国主要的淡水养殖品种之一，然而在养殖过程中极易遭受环境中毒死蜱等有毒物质的危害，导致品质下降甚至减产。因此，解析慢性毒死蜱胁迫影响大口黑鲈抗氧化和免疫功能的分子机制，对培育大口黑鲈优良品种，促进大口黑鲈产业发展具有重要意义。

在饮食中添加抗氧化药物可以在一定程度上减轻毒死蜱造成的氧化损伤。研究发现，姜黄素具有广泛的药理作用，多种药理活性被发现与抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌和抗癌作用有关，对各种慢性疾病、糖尿病、过敏、关节炎、阿尔茨海默病和其他慢性疾病具有潜在的治疗作用。研究发现，长期暴露于毒死蜱可诱导炎症反应，促进细胞凋亡并引起慢性应激症状或疾病，如肥胖、阿尔茨海默病和帕金森病[5-7]。因此，如何改善由毒死蜱引起的氧化胁迫，并降低水产品鱼肉中的残留，具有重要的产业价值。尽管姜黄素已被证明是一种安全的饲料添加剂，可以用于改善水产养殖中鱼类的生长[8]，但姜黄素对慢性毒死蜱暴露的改善作用尚未见报道。

为了探索低浓度毒死蜱长期胁迫对大口黑鲈的影响以及姜黄素在慢性胁迫中的改善效果，笔者通过实时荧光定量技术检测了慢性毒死蜱胁迫下大口黑鲈鳃、肠和肝组织免疫及抗氧化功能中主要基因（抗氧化、紧密连接、免疫和凋亡）的表达量，并通过蛋白印迹技术进一步验证了肝脏中部分基因的表达。我们的研究结果显示，与对照组相比，毒死蜱胁迫导致MDA含量增加了一倍。丙二醛是脂质过氧化过程中的主要终产物，是评价细胞过氧化损伤的重要指标，其水平的显著增加表明慢性毒死蜱暴露引起了机体氧化应激的发生。此外，鳃、肠和肝组织中SOD活性的增强以及CAT、GSH-Px活性的降低与鲤研究一致[9]，这说明抗氧化酶系统在应对外源性污染物胁迫时发挥了重要作用。

转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）是抗氧化系统的关键组成部分，与Keap1结合，并在生理条件下与肌动蛋白细胞骨架结合[10]。当机体出现氧化损伤时，过量的ROS可激活与抗氧化作用元件（antioxidant response element，ARE）结合的 Nrf2，从而调节抗氧化蛋白和Ⅱ期解毒酶的表达[11]。但是，Nrf2在毒死蜱慢性胁迫中是否有效促进了抗氧化功能和免疫功能尚不清楚。通过长达60 d的慢性胁迫，我们的结果发现长期慢性胁迫，上调了大口黑鲈幼鱼鳃、肠道Keap1的表达，但下调了Nrf2基因的表达。在酶活层面和蛋白层面证明，解离的Nrf2基因进一步与ARE结合，启动抗氧化应激系统从而增强肠道的抗氧化能力。然而，肝脏中Nrf2和Keap1先升高后降低，这可能与组织抗氧化能力的差异以及毒死蜱残留水平有关。此外，毒死蜱促进了大口黑鲈鳃、肠和肝组织中 TNF-α、IL-8和 IL-15基因的表达，而TGF-β1基因在20 d时表达上调，并随胁迫时间的延长而降低。而过度和微弱的炎症反应都会导致免疫平衡的丧失，使机体更容易受到病原体的侵害[12]。大口黑鲈鳃、肠和肝组织中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达水平在胁迫后均显著增加，Bax表达上调，Bcl-2表达下调。这些结果表明毒死蜱慢性胁迫促进了凋亡的发生。细胞凋亡的执行因子caspase-3的相对蛋白表达水平明显高于对照组和姜黄素改善组，进一步证实了毒死蜱对细胞凋亡的诱导作用（图1）。

图1 慢性毒死蜱诱导氧化应激和免疫紊乱网络图Figure 1 Network map of oxidative stress and immune disorders induced by chronic chlorpyrifos

姜黄素是一种多酚化合物，在调节转录因子和细胞因子等信号分子方面发挥着有益作用[13]。本研究结果表明，CPF胁迫导致肠紧密连接蛋白Claudin7和Occludin的表达显著下调，而日粮中添加姜黄素可显著增加其表达量，从而改善毒死蜱胁迫引起的肠屏障功能损伤。此外，姜黄素对环境毒性的抗肝毒性作用已被广泛报道，主要通过抑制肝脏炎症、降低氧化应激[14]、增加解毒酶的表达[15]和维持线粒体功能来介导，从而保护肝脏免受纤维化和氧化损伤[16]。但是姜黄素如何通过调节Nrf2来改善由慢性毒死蜱胁迫引起的氧化损伤和免疫紊乱，以及是否能显著降低肌肉中毒死蜱残留尚不清楚。但从我们的结果来看，与毒死蜱胁迫组相比，姜黄素显著促进了Nrf2的表达；显著提高了keap1的表达，从而激活下游抗氧化基因的表达，发挥抗氧化应激作用。同时，与对照组相比，姜黄素显著增加了鳃、肠和肝组织的TGF-β1、IL-10和Bcl-2表达水平，从而起到抗凋亡和抗炎的作用。此外，姜黄素处理组肌肉中毒死蜱残留要显著低于毒死蜱胁迫组。在毒死蜱胁迫后期，姜黄素组Caspase-3、Caspase-8基因的表达大幅上调，但在前期却显著低于毒死蜱胁迫组，这表明只要毒死蜱胁迫处理都会诱导大口黑鲈的炎症反应和细胞凋亡，而姜黄素在胁迫前期可有效改善毒死蜱引起的组织炎症和凋亡；随着氧化应激的加剧，这种改善作用逐渐削弱。综上，姜黄素通过调控Nrf2的表达，激活抗氧化系统，发挥抗氧化功能，降低大口黑鲈受到的胁迫损伤，并可能影响肌肉品质。

虽然补充姜黄素的有益效果在这项研究中得到了证实，但尚不清楚这些保护作用能持续多久。从毒死蜱在肌肉中的富集结果来看，CU组CPF在20、40和60 d内的生物累积量不显著，但仍有增加的趋势（图2）。毒死蜱在体内并不能很快降解，而是缓慢地代谢为CPO（氧合毒死蜱）和TCP（3,5,6-三氯吡啶-2-苯酚），从而引起持续的氧化损伤。因此，这些结果证明，姜黄素并不能改变毒死蜱引起的不可逆损害，只是延迟了毒死蜱的损伤时间，肝脏中Caspase-3和keap1的蛋白表达水平进一步证实了这一点，这可能与姜黄素低的吸收效率相关[17]。因此，长期接触毒死蜱引起的代谢紊乱会干扰鱼类的正常生长，增加水产品的食品安全风险。

图2 毒死蜱和姜黄素处理对肌肉中毒死蜱残留浓度的影响Figure 2 Effects of chlorpyrifos and curcumin on the bioaccumulation of chlorpyrifos in muscle

综上所述，该研究通过模拟自然水体中鱼类受到的慢性毒死蜱胁迫环境，构建了毒死蜱胁迫以及姜黄素改善条件下大口黑鲈抗氧化和免疫应答的实验模型，揭示了慢性毒死蜱胁迫下抗氧化和免疫相关因子调控炎症发生的分子机制，同时为低剂量毒死蜱胁迫下鱼类的治疗手段提供有价值的参考资料。