外源褪黑素对盐胁迫下棉花幼苗生长及光合特性的影响

李 阳，陈 静，刘绍东，沈 倩，张思平，葛常伟，刘瑞华， 马慧娟，万素梅，庞朝友

(1.塔里木大学植物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.棉花生物学国家重点实验室中国农业科学院棉花研究所，河南安阳 455000)

0 引 言

【研究意义】新疆棉花种植面积以及产量均居全国首位[1]。盐碱化给新疆的农业生产带来了挑战[2]。在棉花种子萌发及幼苗时期对逆境胁迫最为敏感[3]。在实际农业生产过程中，通过喷施外源调节剂等对棉花幼苗进行抗逆锻炼缓解盐胁迫的危害尤为重要。【前人研究进展】盐胁迫显著抑制棉花幼苗的生长以及干物质积累，造成株高生长缓慢，叶面积以及光合参数降低[4]。盐胁迫会抑制植物进行光合作用，一方面是无机盐离子毒害的作用抑制了光合色素的活性；另一方面是过多的无机盐离子影响植物细胞渗透势从而影响光合速率。植物在逆境胁迫下净光合速率呈下降趋势，有机物合成减少，导致植物无法正常生长[5]。褪黑素作为抗氧化剂，既能在植物体内自身合成，也能通过施加外源褪黑素达到增强逆境胁迫抑制的目的[6]。杜天浩[7]研究表明，在盐胁迫下，施加外源褪黑素能显著增加番茄幼苗叶绿素的含量。根施外源褪黑素的方式能明显减缓盐胁迫对葡萄幼苗的损伤，并利于葡萄叶片进行光合作用[8]。研究表明，外源褪黑素能够促进植物叶片光合相关基因转录水平的表达，达到保护叶片光合系统的目的[5]。褪黑素在参与植物叶片进行光合作用中发挥积极影响，通过对植物叶片光合结构以及PSII合成相关蛋白的表达提高光合作用效率。【本研究切入点】有关外源褪黑素能缓解棉花在逆境胁迫下抑制作用的报道相对较少，其中陈莉等[9]发现通过外源褪黑素浸种处理后，20 μmol/L褪黑素处理能提高棉花种子发芽率，增强棉花种子耐盐性。袁志刚[10]研究表明，将100 μmol/L褪黑素进行灌根处理后，降低NaCl胁迫下棉花叶片中的Na+含量，抑制叶绿素含量的增长。通过喷施外源褪黑素抵御棉花幼苗在NaCl胁迫下，有关光合系统如何响应的研究尚未报道。研究外源褪黑素对盐胁迫下棉花幼苗生长及光合特性的影响。【拟解决的关键问题】采用叶面喷施外源褪黑素的方法，研究在NaCl胁迫下棉花幼苗生长指标、光合参数等生理指标，分析外源褪黑素对棉花耐盐能力的影响，以及外源褪黑素能够缓解棉花幼苗在盐胁迫下的生理机制，为研究棉花耐盐栽培措施提供有利依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试棉花品种为新陆中70号。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

试验在中国农业科学院棉花研究所温室进行。挑选颗粒饱满的棉籽，用0.1% HgCl2消毒处理后清洗4～5次。种于蛭石培养钵，间隔1 d浇等量蒸馏水。待子叶展平，挑选生长一致幼苗移入含有550 mL 1/4 Hoagland 营养液的水培盒中。7 d后转为等量1/2 Hoagland水培盒中。待第4片真叶展平时进行NaCl处理，并叶面喷施外源褪黑素。测定NaCl胁迫下不同时间段(1、3、6和9 d)棉花幼苗生长指标、叶绿素含量及荧光、光合参数等指标。

叶面喷施设置4个不同褪黑素(MT)浓度处理及2个对照处理，分别是：

CK1：0 μmol/L MT+0 mmol/L NaCl；

CK2：0 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T1：25 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T2：50 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T3：100 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl；

T4：200 μmol/L MT+150 mmol/L NaCl。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 棉花苗期生长指标

喷施等量不同浓度褪黑素处理并在盐胁迫1、3、6和9 d时取样，测定棉花株高、茎粗、叶面积以及生物量。每个处理选取5株幼苗测定。

1.2.2.2 叶绿素含量

称取棉花主茎叶倒三叶0.2 g，将叶片剪碎放置于20 mL玻璃试管中，加入10 mL 95%酒精并遮光浸泡48 h，在此期间多次摇晃直至叶片完全失绿，用UH5300型分光光度计(日本日立公司生产)在波长为665、649、470 nm下测定吸光度，并计算叶绿素a、叶绿素b含量和总叶绿素含量。

1.2.2.3 叶片光合作用参数

采用美国Li-Cor公司的便携式光合系统分析仪Li-6400测定主茎叶净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)等参数。使用闭路式气路，内置光源，并采用钢瓶控制二氧化碳浓度，设定CO2浓度为400 μmol/mol，流速为500 μmol/s，光强为1 000 μmol/(m2·s)。环境温度控制在25℃，相对湿度控制在70%左右，每个处理选取5株幼苗测定。

1.2.2.4 叶绿素荧光动力学参数

选取棉花幼苗主茎叶倒三叶，每个处理测定5株。将幼苗叶片进行暗适应20 min后，用Handy-PEA荧光仪(英国汉莎公司生产)测定叶片暗适应初始荧光F0和最大荧光Fm，在600 μmol/(m2·s)作用光下获取最大荧光(Fm′)和稳态荧光(Fs)，并开远红光获得初始荧光(Fo′)。参照Baker等[11]方法计算Fm、Fo、Fm′、Fs 和 Fo′，获得PSII反应中心实际光化学效率(φPSII)，非光化学淬灭系数(NPQ)，PSII有效光量子产量(Fv′/Fm′)，光化学淬灭系数(qP)。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件处理数据，用DPS V7.05软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗生长的影响

2.1.1 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗株高、茎粗和叶面积的影响

研究表明，NaCl(CK2)胁迫会阻碍棉花幼苗生长，株高随着NaCl胁迫时长受到显著抑制，在NaCl胁迫1、3、6和9 d时与对照相比分别降低6.7%、14.1%、15.5%和18.0%。喷施不同浓度外源褪黑素处理后，延缓了NaCl胁迫对株高的影响，其中喷施100 μmol/L褪黑素效果较好。NaCl胁迫1和3 d时，喷施外源褪黑素处理对棉花幼苗茎粗和叶面积无显著差异；NaCl胁迫6和9 d后，100 μmol/L褪黑素处理与CK2相比幼苗叶面积有显著差异，分别提高了10.5%和8.1%。表1

表1 外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗生长特性变化Table 1 Effects of exogenous melatonin on growth characteristics of cotton seedlings under NaCl stress

2.1.2 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗植株干物质积累及分配的影响

研究表明，随着NaCl胁迫时间的增加，对棉花幼苗干物质积累造成显著影响。棉花幼苗地上部干重、总干重均呈显著下降趋势。喷施外源褪黑素处理后幼苗地上部干重、总干重均有不同程度的增加，其中喷施100 μmol/L褪黑素处理较好，总干重在盐胁迫1、3、6和9 d时，与CK2相比分别提高了25.3%、23.0%、29.3%和53.0%。表1

2.2 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗叶片光合参数的影响

2.2.1 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗叶片光合色素含量的影响

研究表明，NaCl胁迫会显著降低幼苗叶片Chla、Chlb和Chla+Chlb的含量，对Chla/Chlb影响不大，NaCl胁迫处理1 d时，棉花幼苗叶片Chla、Chlb和Chla+Chlb含量分别下降了24.8%、16.8%和22.3%。随着NaCl胁迫时间的增加，叶片光合色素含量各指标呈先上升后下降的趋势。与CK2相比，NaCl胁迫3和6 d时，喷施100 μmol/L褪黑素处理显著提高Chla含量，分别为16.2%和11.1%。表2

表2 外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗叶片光合色素含量变化Table 2 Effects of exogenous melatonin on photosynthetic pigment content in leaves of cotton seedlings under NaCl stress

2.2.2 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗叶片光合参数的影响

研究表明，随着处理时间的增加，Pn、Gs、Tr均呈先上升后下降的趋势，Ci无明显变化。NaCl胁迫会导致植物净光合速率下降。与CK1相比NaCl胁迫(CK2)显著降低棉花幼苗叶片的Pn、Tr、Gs和Ci。喷施外源褪黑素处理后，叶片的光合气体参数都有不同程度的增加。其中T3处理缓解效果最好，显著提高Pn含量。与CK2相比，NaCl胁迫1、3、6和9 d时，100 μmol/L褪黑素处理下，Pn分别提高了73.4%、49.6%、42.9%和26.4%，Gs分别提高了28.6%、14.3%、31.3%和30.0%，Tr分别提高了17.3%、23.4%、37.7%和19.1%。图1

注：(Pn)净光合速率、(Gs)气孔导度、(Ci)胞间CO2浓度、(Tr)蒸腾速率。同列中不同字母表示在P<0.05水平差异显著

2.3 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

研究表明，PSII反应中心实际光化学效率、PSII有效光量子产量、光化学淬灭系数和非光化学猝灭系数这4项荧光指标在NaCl胁迫下均具有显著差异。喷施外源褪黑素处理第1 d～第9 d中，φPSII随着NaCl处理时间变化，基本保持在0.4～0.6。NaCl胁迫处理第1 d～第9 d中，φPSII呈先上升后下降，均低于CK1处理。喷施外源褪黑素处理提高NaCl胁迫下叶片φPSII，第9 d时φPSII值最低。Fv′/Fm′同φPSII变化趋于一致。NaCl胁迫下qP低于CK1处理，喷施外源褪黑素处理后，qP趋于平缓上升趋势。NaCl胁迫提高NPQ，喷施外源褪黑素处理NPQ下降。图2

2.4 相关性分析

研究表明，在处理6 d时，除了Chla/Chlb指标之外，其他指标与总干重达到极显著相关性，与净光合速率和蒸腾速率相关性较高，达到极显著或显著水平。通过Chla+Chlb含量的变化来影响光合系统Ⅰ和Ⅱ。表3

3 讨 论

3.1 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗生长的影响

NaCl胁迫严重阻碍棉花幼苗生长，通过喷施外源褪黑素的方法能有利于减轻NaCl胁迫对棉花幼苗抑制作用，张娜等[12]研究表明，褪黑素处理能提高狼尾草种子的萌发能力，减轻了盐胁迫对狼尾草幼苗生长的影响。盐胁迫下，外源褪黑素能有效增加大豆生物量的积累，缓解大豆株高受到抑制作用，保持幼苗叶片相对含水率的稳定性[13]。试验结果表明，棉花幼苗的株高、叶面积、干物质积累指标与CK2相比有显著性差异。喷施100 μmol/L褪黑素处理，能有效促进棉花幼苗株高生长及生物量增加，喷施外源褪黑素能增强NaCl胁迫下棉花幼苗耐盐性，减少对棉花幼苗的伤害。

注：(φPSII)PSII反应中心实际光化学效率、(Fv'/Fm')PSII有效光量子产量、(qP)光化学淬灭系数、(NPQ)非光化学猝灭系数。同列中不同字母表示在P<0.05水平差异显著

注：*和**分别表示在0.05和0.01水平上显著

3.2 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗光合指标的影响

植物遇到逆境时，植物叶片光合作用会受到影响，NaCl胁迫下，棉花幼苗光合色素以及光合指标显著降低。盐胁迫能够通过气孔性限制和非气孔性限制来调节植物的光合作用；同时也会影响植物叶绿素的合成，过多的NaCl会导致已经合成的叶绿素分解，造成叶绿素含量下降[14]。喷施外源褪黑素后，各指标均有不同程度的增加。高立杨等[15]研究表明，喷施外源褪黑素可降低盐碱复合胁迫下垂丝海棠叶片相对含水量、叶绿素相对含量和 Pn、Gs、Tr指标的幅度，并具有明显的浓度效应。外施褪黑素能有效降低盐胁迫下番茄幼苗PSII，减缓叶绿素含量及Pn降低，增强番茄幼苗的耐盐能力[16]。试验中，NaCl胁迫下，Pn呈下降趋势，可能是因为NaCl胁迫影响了棉花幼苗根系的活力，导致叶片气孔部分关闭，Ci也出现下降趋势。气孔限制也是棉花幼苗叶片净光合速率下降的原因。当喷施100 μmol/L褪黑素处理后，Pn、Gs、Ci和叶绿素含量都有所增加，可能是因为褪黑素对PSII潜在的活性有促进作用。褪黑素能有效调节NaCl胁迫下棉花幼苗叶片的光合作用，提高NaCl胁迫下棉花幼苗叶绿素的含量，对棉花幼苗耐盐性有促进作用。

3.3 喷施外源褪黑素对NaCl胁迫下棉花幼苗荧光指标的影响

棉花幼苗叶片PSII活性会受到NaCl胁迫的约束，叶片φPSII、Fv′/Fm′以及qP呈下降趋势。φPSII表示PSII反应中心实际光化学效率，由于碳固定下光合电子合成减少从而导致φPSII下降，进一步说明了NaCl胁迫能够通过非气孔因素表达对植物光合系统的响应。qP表示PSII原初电子受体QA的氧化还原状态，qP值越大，说明PSII电子传递的活性较高。

qP下降说明了PSII受到损伤后，阻碍了光合电子的传递，有效反应光下降。Fv′/Fm′下降是因为光捕捉后没有迅速进行光合电子传递，直接通过叶绿素的转化消耗光能，同时导致PSII下降。NPQ是非光化学淬灭指标，反映了叶绿素吸收及转化的过程。干旱胁迫下，外源褪黑素有效增强玉米幼苗叶绿素含量，降低NPQ，防止光合系统受损[17]。研究表明[18]在高盐胁迫环境下，PSII反应中心实际光化学效率也会受到显著制约，其功能受到损害。在试验中，NaCl胁迫造成NPQ上升，同时也是造成PSII、Pn下降的原因。通过叶面喷施100 μmol/L褪黑素，φPSII、Fv′/Fm′以及qP都有不同程度提高，NPQ下降，说明了褪黑素能有效提高棉花叶片PSII光化学效率和光合速率。

4 结 论

4.1叶面喷施外源褪黑素能延缓NaCl胁迫对棉花幼苗的损伤，有利于幼苗株高、茎粗以及叶面积的生长。喷施褪黑素处理，能有效调控棉花幼苗在NaCl胁迫下生物量的变化。喷施外源褪黑素在NaCl胁迫下幼苗叶片Chlb、Chla/Chlb上无明显表现，仅显著表现在Chla上。外源褪黑素处理能显著提高棉花幼苗NaCl胁迫下光合作用的能力。NaCl胁迫显著降低幼苗叶片φPSII和Fv′/Fm′，喷施外源褪黑素能有效缓解Fv′/Fm′持续下降的趋势。

4.2NaCl胁迫下喷施100 μmol/L褪黑素能促进棉花幼苗生长发育，显著提高棉花幼苗叶片光合色素含量，有效提高棉花叶片PSII光化学效率和光合速率，增强棉花幼苗耐盐能力。