应用RP-HPLC法测定野山杏果肉黄酮类化合物

戴小华，谷虹霏，金科旭，束佳敏，杨若蓝，吴梦岚，潘 慧，赵红琼

(新疆农业大学,乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】野山杏〔Armeniacasibirica(L.) Lam.〕果肉中含有多种黄酮类化合物，黄酮类化合物具有多种生物活性及药理作用。近年来对黄酮及黄酮类化合物的不同分析检测方法进行了多个研究，研究新疆野山杏总黄酮的提取分离方法，对开发利用新疆特色药食同源植物提供有实际意义。【前人研究进展】高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)具有灵敏度高、流动相和色谱柱选择范围广、分析速度快、流出组分易收集等特点[1]，选择该方法进行成分分析较普遍。张元梅等[2]研究利用高效液相法同时检测柑橘果实中18种黄酮类化合物的含量，分离效果良好；左月明等[3]等采用RP-HPLC法在40 min内梯度洗脱同时检测出三白草药材中芦丁、槲皮素等黄酮类化合物的含量；WANG等[4]在流速1.0 mL/min下梯度洗脱 25 min内同时分离检测冷蒿地上部分7种黄酮类化合物含量。【本研究切入点】关于野山杏黄酮及黄酮化合物的提取及分离方面报道较少。研究运用高效液相色谱法，建立一种简便、快速、准确的测定方法。【拟解决的关键问题】采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法，分析检测波长、流动相、流速、柱温等因素确定色谱条件，运用系统适用性试验、精密度实验、稳定性实验、重复性实验、加样回收率实验，验证野山杏果肉中4种黄酮类化合物的含量分析方法。

1 材料与方法

Hubble C18(1.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；高效液相色谱系统:岛津LC-20A型高效液相色谱仪、SPD-20A型检测器、SIL-20A型进样器、LC-20AT型输液泵、CTO-20A型柱温箱(日本岛津公司)。

野山杏果实采自新疆哈密地区伊吾县，经新疆农业大学食药学院药用植物实验室鉴定为野山杏〔Armeniacasibirica(L.)Lam.〕的干燥果肉。芦丁(批号Y22S6S3719，纯度为98%)、原花青素(批号Y22F7Y17095，纯度为95%)、槲皮素(批号C20J6Y1722，纯度为98%)、柚皮苷二氢查尔酮(批号H05S6K3043，纯度为98%)均购自上海源叶生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)、磷酸(分析纯)。

1.2 方 法

1.2.1 溶液制备

1.2.1.1 对照品溶液配制

称取原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素4种对照品各(10.00±0.20)mg，用甲醇溶解并分别定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液。

1.2.1.2 混标储备液

分别取上述溶液各2.50 mL，混合均匀，制得含有原花青素106.00 μg/mL、芦丁103.00 μg/mL、柚皮苷二氢查尔酮112.00 μg/mL、槲皮素104.00 μg/mL的混标储备液。

1.2.1.3 混标中间液及混标工作液

准确量取5 mL混标溶液甲醇定容至10 mL，制得含有原花青素53.00 μg/mL、芦丁51.50 μg/mL、柚皮苷二氢查尔酮56.00 μg/mL、槲皮素52.00 μg/mL混标中间液。

分别取0.25、0.50、1.00、2.00 mL中间液甲醇定容至10 mL容量瓶，摇匀，配制标准工作液上机待测。

不同浓度的混合对照品溶液，采用优化的色谱条件，测定新疆野山杏果肉中4种黄酮类化合物成分的峰面积，以各对照品溶液中黄酮成分浓度为横坐标(x)、峰面积值为纵坐标(y)，制作标准曲线图并计算线性回归方程。精密移取黄酮混合对照品，并连续6次进样，测定峰面积并计算RSD值。取供试品溶液，供试品溶液6份，按优化的色谱条件，分别于0、1、2、4、6、8 h测定峰面积。取同一供试品溶液，在色谱条件下，连续进样6次，测定得到峰面积。以各待测成分峰面积为指标，计算原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素峰面积的RSD值。称取野山杏果肉粉末1.0 g，制备供试品溶液，进样量10 μL。按高、中、低3个浓度水平进行加样回收实验，且每个浓度平行3次。称取6份同一野山杏果肉干燥粉末，制备供试品溶液。用微孔滤膜(0.22 μm)过滤并根据色谱条件进样测定。

1.2.1.4 供试品溶液配制

取1 g野山杏干燥果肉，粉碎，过40目筛，加50%乙醇(料液比1∶50)，70℃下超声1 h，超声提取2次，抽滤，合并滤液旋蒸浓缩后，用甲醇定容至10 mL，摇匀，制成供试品溶液，测定前用微孔滤膜(0.22 μm) 过滤，备用。图1

1.2.2 色谱条件的优化

1.2.2.1 检测波长选择

取对照品溶液，采用二极管阵列检测器对各成分吸收峰进行扫描，通过3D图谱对各对照品的吸收峰进行分析，确定对照品溶液的最大吸收波长。

1.2.2.2 流动相选择

黄酮类化合物都微溶于水，同时溶于有机溶剂，在C18色谱柱应用中，选用甲醇-水溶液作流动相时分离黄酮类化合物效果最佳。根据待测物的理化性质及文献报道[5]，采用甲醇-磷酸水溶液作为流动相。

1.2.2.3 流速选择

在固定相和流动相不变的情况下，分析0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min 4种不同流速下色谱峰分离情况。

1.2.2.4 柱温选择

在流动相和固定相不变的情况下，分别在25、30、35℃下，以出峰时间为测定依据，分析不同柱温对色谱峰的影响。

1.2.2.5 色谱条件

取各对照品溶液、供试品溶液、溶剂空白依次进样，原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素4种黄酮类化合物均在270 nm左右有共同的吸收峰带，经分析比照后得到对照品混合溶液最大吸收波长为273 nm。图1

Hubble C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相A(甲醇)∶B(0.5%磷酸水溶液)=45∶55，以1.0 mL/min流速进行等度洗脱，柱温箱温度为35℃，检测波长为273 nm，进样量为10 μL。

1.3 数据处理

采用Excel 2010、SigmaPlot 12.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 系统适用性

研究表明，溶剂空白和对照品、样品溶液无干扰作用，则检测条件符合要求。图4～6

图2 不同流速下各黄酮成分保留时间变化Fig.2 Effect of different flow rateon the retention time of different flavonoids

图3 不同温度下各黄酮成分保留时间变化Fig.3 Effect of different temperature the retention time of different flavonoids

图4 溶剂空白色谱峰Fig.4 Chromatogram of Solvent

注：1.原花青素；2.芦丁；3.柚皮苷二氢查尔酮；4槲皮素

注：1.原花青素；2.芦丁；3.柚皮苷二氢查尔酮；4槲皮素

2.2 标准曲线的制备

研究表明，野山杏果实中原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素在各自浓度范围内具有良好的线性关系。表1

表1 标准曲线方程(n =6)Table 1 Quation of standard curve line(n=6)

2.3 精密度

研究表明，原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素峰面积分别为0.88%、0.14%、0.14%、0.44%(n=6)。表2

表2 精密度(n =6)Table 2 Result of Precision experiment(n=6)

2.4 稳定性

研究表明，供试品溶液的色谱峰面积没有明显改变。原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素峰面积的RSD值分别为1.82%、0.77%、未检出、1.93%(n=6)，原花青素、芦丁和槲皮素稳定性良好。表3

表3 稳定性(n =6)Table 3 Result of stability experiment(n=6)

2.5 重复性

研究表明，原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素峰面积的RSD值分别为1.88%、2.69%、未检出、3.31%(n=6)，该方法检测原花青素、芦丁和槲皮素重复性较好。表4

表4 重复性实验结果(n =6)Table 4 Result of reproducibility experiment(n=6)

2.6 加样回收率

研究表明，除柚皮苷未检出，槲皮素低、中组未检出，各黄酮类化合物成分的加样回收率在92.13%～96.70%，黄酮类化合物成分原花青素和芦丁的回收率良好。表5

2.7 样品含量

研究表明，新疆野山杏果肉中4种黄酮类化合物成分的含量，其中柚皮苷未检出，槲皮素、原花青素、芦丁含量不等，其中原花青素含量最高。表6

表5 样品加标回收率(n =3) Table 5 Result of recovery experiment(n=3)

表6 野山杏果肉黄酮成分含量(n =6)Table 6 Result of component content determination of flavonoids in TFWA(n=6)

3 讨 论

野山杏果肉中含有丰富的黄酮类化合物，但不同地区以及不同部位黄酮的含量和种类有一定差异，用RP-HPLC法分析野山杏黄酮类成分的报道较少。闫伟伟等[6]建立了杏花药材(HPLC)指纹图谱测定方法并对不同产地的杏花药材进行质量评价，张丽丽等[7]采用高效液相色谱法测定了5个杏品种果肉中的可溶性糖和有机酸，张玲等[8]采用HPLC定量分析方法对3个仁用杏品种杏仁中的苦杏仁苷质量分数进行了检测, 韩海霞等[9]利用HPLC法测定了新疆巴旦杏中苦杏仁苷的含量；罗慧玉等[10]利用HPLC法测定了杏花中阿魏酸、芦丁和异槲皮苷的含量，其中芦丁的含量为3.080～6.933 mg /g，张元梅等[11]研究利用高效液相法同时检测柑橘果实中18种黄酮类化合物的含量，具有良好的分离效果。左月明等[12]等采用RP-HPLC法在40 min内梯度洗脱同时检测出三白草药材中芦丁、槲皮素等黄酮类化合物的含量。实验测定的芦丁含量高于文献报道的，故进一步说明不同部位黄酮的含量和种类有一定差异。

在对流动相进行选择时，实验初步选择水-甲醇系统作为流动相，混合对照品溶液中各成分色谱峰分离效果不佳，后加入磷酸进行调节，直到调节到流动相V甲醇∶V 0.5%磷酸溶液=45∶55时，4种黄酮类化合物成分色谱峰在20 min内完全分离，峰形对称且分离度良好。

实验中测定的4种成分为3种不同类型的黄酮类化合物，即黄酮醇类、查尔酮类、花色素类，如若要测定野山杏更多类型的黄酮类化合物可在实验流动相为V甲醇∶V 0.5%磷酸溶液=45∶55的基础上，调节流动相配比，必要时进行梯度洗脱，就可进一步建立测定分析野山杏多种黄酮化合物成分及含量的方法。

在各黄酮类化合物成分的含量检测中，由于柚皮苷二氢查尔酮在野山杏中含量极低，低于检测限，故在含量检测时未检出，在研究过程中进一步探讨同时测定柚皮苷二氢查尔酮含量的最优条件。

4 结 论

采用RP-HPLC法分析了新疆野山杏果肉中的原花青素、芦丁、柚皮苷二氢查尔酮、槲皮素等4种黄酮类化合物，其中原花青素、芦丁、槲皮素3种黄酮成分色谱峰在20 min内分离度良好，线性范围为0.52～56 μg/mL(r= 0.999 8～1)，加样回收率为92.13%～96.70%，RSD为0.89%～1.96%，在该条件下测得的原花青素的含量为7.325 mg/kg，芦丁的含量为0.630 mg/kg，槲皮素的含量为0.009 58 mg/kg，3种黄酮类化合物中原花青素含量最高；一种黄酮类化合物即柚皮苷二氢查尔酮在该条件下未检出。RP-HPLC法可对新疆野山杏果肉中3种黄酮类化合物成分进行分析，该法简便、准确、快速、稳定性及重复性好，可为野山杏中黄酮类化合物的快速检测提供实验依据。