基于网络药理学探讨人参-甘松药对治疗阵发性房颤的作用机制

郭经奇，李 莹，范吉林，任雯庆，薛振宇，张世亮

（1.山东中医药大学，2.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014）

阵发性房颤（PAF）是我国常见心律失常的一种，发病时心房颤动，心室出现不规则快速的收缩，有时伴有胸闷、憋气、心慌等症状，严重者可出现休克导致死亡，必须给予有效的治疗和预防［1，2］。目前临床上该病治疗以西药为主，虽然西药取得了一定的疗效，但仍会导致其他心律失常，副作用明显。大量临床实验和经验证明，中医中药不仅治疗PAF效果较好，还能改善西药带来的不良反应。再者，随着大众对中医中药认知度、认可度的增高，中医药的应用显得尤为重要。

人参、甘松是张世亮教授临床上治疗阵发性房颤的常用药对，长期的临床观察发现该药对的应用不但能明显降低房颤发作次数和每次发作的时间，而且对心、脑、肾等器官的保护也有效果。人参药用部位是根与根茎，中医认为其能补五脏，安魂魄，贵为药中之上品，大补元气，气足则血充，气血充足则脉搏调和，甘松药用部位也是干燥根与根茎，辛香行散，入肝脾心经，能理气止痛，醒脾健胃，止惊悸安神［3］，人参、甘松合用既能补气行气，又能安神止惊。现代药理研究发现，人参中有40 多种皂苷，在神经、心血管、内分泌疾病中具有积极作用，人参皂苷Rg1 具有抗炎抗氧化作用，而且能减轻大鼠心肌损伤后心律失常的发生率［4，5］，甘松具有抗心律失常、抗抑郁、提高心肌耐受缺氧能力等作用［6］。现中医学者多把甘松作为君药或臣药来治疗PAF。其中参松养心胶囊就配伍人参甘松来治疗心律失常。目前研究更多的是关注单个药物和单种成分的作用，而临床证明中药复方在缓解PAF 症状，调节心律，提高生活质量上取得很好疗效［7］。而人参-甘松药对治疗阵发性房颤的作用机制尚不明确，其系统性研究少有报道，本研究基于网络药理学，系统分析该药对的有效活性成分和作用靶点，利用数据库分析核心蛋白并通过GO 和KEGG 分析主要功能和主要途径，为指导临床和今后的深入研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物潜在有效成分的获取

登录中药系统药理学数据库（TCMSP http：//lsp.nwu.edu.cn/），分别以人参和甘松为关键词进行检索，获得人参和甘松所有的化学成分，包括化学成分的名字（moleclue name）、生物利用度（OB）、类药性（DL）等。众所周知，药物不是所有的化学成分都能发挥治疗作用，OB 包括生物利用程度和生物利用速度，程度是指中药经口服进入机体吸收入血后，经过肝脏首过效应进入血液循环的药量百分比，速度则指药物进入血液循环达到有效剂量的时间。OB 是决定药物的化学成分是否具备有效活性的关键指标。DL 是指化学成分与已知药物的相似度，可体现此化学成分成为药物的可能性。结合文献研究，将OB≥30%，DL≥0.18 为条件，筛选出人参和甘松的潜在有效成分。

1.2 药物潜在靶点的获取

继续通过TCMSP 数据库检索人参和甘松的所有成分的靶点，并与已得到的潜在成分相映射，获得潜在靶点，利用Uniprot 数据库（http：//www.uniprot.org/）将人参和甘松有效靶点与人类相关基因相对应，获得药物的潜在靶点。

1.3 阵发性房颤靶点的获取

登 录GeneCards 数 据 库（https：//www.genecards.org/），以paroxysmal atrial fibrillation 为关键词进行检索，获得阵发性房颤的所有相关靶基因，并导出到Excel，为后续处理做准备。

1.4 药物疾病靶点韦恩图的绘制

为了观察人参-甘松药对与阵发性房颤的关联，利用绘图网址（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），将已获得的药物潜在靶点和疾病靶点导入，从而获得韦恩图。通过韦恩图可以更加直观的看出，人参-甘松药对是通过多基因、多靶点来治疗阵发性房颤。

1.5 药物-疾病-活性成分-靶点网络构建

将药物疾病映射的共同靶点与药物的有效活性成分导入Cytoscape3.7.2 软件，构建药物-疾病-活性成分-靶点网络图。

1.6 核心靶标PPI 网络构建

为了进一步获取关键靶点，利用STRING 数据库（https：//string-db.org/），将药对和疾病的共同靶点导入该数据库，并限定物种为人类物种（Homo sapiens），获得蛋白互作网络图（PPI），检索研究相关文献，为确保可信度，将交互分数限定为＞0.4，去除无相互作用的单一蛋白，获得最终的PPI 网络图，导出图片并以TSV 格式保存结果，利用R x64 3.6.2软件，将结果挑选出前30 名核心靶标，并绘制柱状图。

1.7 GO 分 析 与KEGG 通 路 分 析

为了分析人参-甘松药对作用于阵发性房颤的生物功能过程和通路传导过程，从而更清晰的阐述作用机制，利用DAVID 数据库（http：//david.ncifcrf.gov/）对筛选出的药物和疾病的共同靶点基因进行GO 分析和KEGG 分析。

2 结果

2.1 潜在有效成分筛选结果

通过TCMSP 数据库收集到，人参190 个化学成分，甘松57 个化学成分，共247 个化学成分。以OB≥30%，DL≥0.18 作为条件，筛选得到潜在的有效成分，人参22 个潜在成分，甘松6 个潜在成分，共获得28 个潜在有效成分，如豆甾醇、β-谷甾醇、人参皂苷Rh2、金合欢素、隐丹参酮、刺槐碱等，见表1。

表1 人参-甘松药对潜在有效成分Tab 1 Potentially active components of Renshen-Gansong drug pairs

2.2 药物疾病靶基因结果与韦恩图的绘制

在获得的人参甘松28 个潜在有效成分中，通过Uniprot 数据库共找到人类相关靶点97 个，通过GeneCards 数据库共找到阵发性房颤靶点750 个，利用绘图网址，得到药物与疾病的共同靶点45 个，并绘制出韦恩图，见图1。

图1 药物疾病靶点韦恩图Fig 1 Venn diagram of drug disease target

2.3 药物-疾病-活性成分-靶点网络构建

将有效成分与共同靶点导入Cytoscape3.7.2 软件获得可视化的调控网络图，见图2。图中节点包括药物、疾病、活性成分、靶点，而边则表示他们之间存在相互关系，红色菱形代表疾病和药物，绿色圆形代表人参活性成分，蓝色圆形代表甘松活性成分，黄色三角形代表靶点基因，通过此网络直观的看出人参-甘松药对治疗阵发性房颤是通过多种成分、多种靶点来发挥作用。

图2 药物-疾病-活性成分-靶点网络图Fig 2 Drug-disease-active components-target network diagram

2.4 蛋白互作网络图与核心靶标柱状图

利用STRING 数据库获得蛋白互作网络图，见图3，图中共有50 个节点，310 条边，节点代表蛋白，浅蓝色边代表来自管理的数据库（from curated databases），紫色边代表实验测定（experimentally determined），绿色边代表基因相邻（gene neighborhood），红色边代表基因融合（gene fusions），深蓝色边代表基因共现（gene co-occurrence），黄色边代表文本挖掘（textmining），黑色边代表共表达（co-expression），淡蓝色边代表蛋白质同源性（protein homology）。利用R 软件挑选出前30 位核心靶标并绘制柱状图，见图4，如P53 蛋白、前列腺素内过氧化物合酶2、肿瘤坏死因子、白细胞介素-1β、JUN 蛋白、丝裂原激活蛋白激酶14、内皮一氧化氮合成酶、雌激素受体1、血红素加氧酶1 等，提示这些靶标可能为人参甘松治疗阵发性房颤的关键核心成分。

图3 蛋白互作网络图Fig 3 Protein interaction network diagram

图4 核心靶标柱状图Fig 4 Histogram of core targets

2.5 GO 分 析 与KEGG 通 路 分 析

利用DAVID 数据库将筛选出的疾病和药物共同靶点进行GO 分析，为了数据更准确，设置pvalueCutoff 为0.05，共得到了80 条GO 生物功能，选取前20 的主要功能绘制气泡图，见图5。参与的功能主要有神经递质受体活性（Neurotransmitter receptor activity）、核受体活性（nuclear receptor activity）、被动跨膜转运蛋白活性（passive transmembrane transporter activity）门控通道活动（gated channel activity）、离子通道活性（ion channel activity）的调节，血红素结合（heme binding）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding）等。继续进行KEGG 通路富集分析，共获得114 条通路，选取前20 条绘制柱状图，见图6，参与的通路包括信号通路，如IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、钙信号通路（Calcium signaling pathway）、TNF 信号通路（TNF signaling pathway）、VEGF 信 号 通 路（VEGF signaling pathway）等，其他通路如流体剪应力与动脉粥样硬化通路（Fluid shear stress and atherosclerosis）、5-羟色胺能突触通路（Serotonergic synapse）、心肌细胞中的肾上腺素能信号转导通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）等，结果显示人参-甘松药对治疗阵发性房颤与多种生物功能、多种通路密切相关。

图5 前20 生物功能气泡图Fig 5 Top 20 biological function bubble chart

图6 前20 通路柱状图Fig 6 Histogram of the top 20 channels

3 讨论

阵发性房颤目前是我国常见心律失常之一，人口老龄化的加重，导致其患病率增加。小于60 岁人群患病率约1%，75～84 岁患病率约12%，大于80岁患病率超过1/3［8］。如此高的患病率，不仅给家庭带来较大的生活压力，也给社会带来经济负担［9］。阵发性房颤在祖国医学中称为“心悸”、“怔忡”，其基本病机主要是脏腑气血虚衰失调，人参补气之力甚佳，气充则血充，又能安五脏，恰中病机。甘松能行气解郁开窍，入心经，能安心神、定心悸、养心血，入脾经，能理气，调节气机升降，使补而不滞。人参、甘松合用，具有补心止悸之效。

本研究基于现代药理研究与网络药理学平台探讨人参-甘松药对治疗阵发性房颤的作用机制，共收集到28 种有效成分。如豆甾醇（Stigmasterol）属于植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、降低胆固醇、抗糖尿 病 的 作 用［10］。张 浩 楠 等［11］通 过 豚 鼠 实 验 证 明，β-谷甾醇（beta-sitosterol）和山奈酚（kaempferol）具有抗心律失常的作用。山奈酚具有抗炎，抗氧化，调节免疫，保护心肌等作用［12］。甘春丽等［13］研究发现，山奈酚黄酮醇类化合物能选择性阻断L 型钙通道，拮抗钙超载，保护心肌细胞。研究表明金合欢素（acaciin）能抗炎抗氧化，抗癌，调节免疫，保护心脏 等 作 用［14］。Wu 等［15］通 过 研 究HEK293 细 胞 发现，金合欢素能抑制hKv4.3 电流并降低失活后的恢复，通过对hKv4.3 的使用和阻断可能对房颤的治疗有作用。隐丹参酮（cryptotanshinone）能抗心血管疾病，改善微循环，改善心肌供血，抗炎抗氧化［16］。综合看来，人参-甘松可能通过抗炎抗氧化，调节hKv4.3 等过程治疗阵发性房颤。

药物-疾病-活性成分-靶点网络图的构建，可直观感受到人参-甘松药对治疗阵发性房颤是通过多成分，多靶点发挥作用。PPI 网络图显示各蛋白靶点之间关系密切，相互作用最多的前4 位蛋白靶点为P53 蛋白（TP53）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1β（IL1B）。研究表明，P53 基因虽是重要的抑癌基因，但其在各种细胞中广泛存在，并与心血管疾病密切相关，能抑制细胞凋亡，抗动脉粥样硬化，改善心肌缺血，相信随着对P53 基因研究的不断深入，能发现在心血管其他疾病中的重要作用［17］。郭丽娜等［18］通过研究发现，葛根通过多靶点多途径治疗心血管疾病，预测到可能与PTGS2 基因的表达有关，PTGS2 基因参与肿瘤、炎症反应等多种病理生理过程。相关临床研究显示，炎症在房颤的触发和维持中发挥重要作用，TNF-α 作为炎症因子通过改变离子通道，导致心房重构，增加房颤的发病率，且在房颤患者中，TNF-α 水平明显增高［19-21］。Wang 等［22］通过对犬的实验发现，IL-1β 能显著激活心脏左侧星状神经节这一重要交感神经成分，从而发生室性心律失常。张倩倩等［23］也通过犬实验发现，IL-1β 能显著激活心房神经节丛，诱导房颤的发生，并促进房颤患者心房纤维化。因此蛋白互作网络也体现出作用机制是复杂多样的。

GO 分析和KEGG 分析结果显示，人参甘松治疗阵发性房颤主要涉及炎症因子信号通路，包含IL-17 信号通路、TNF 信号通路；信号传导通路，包含糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、VEGF 信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号转导通路；离子转运相关通路，包含钙信号通路等；疾病信号通路，包含利什曼病通路、非洲锥虫病等。因此推断，人参、甘松药对治疗阵发性房颤可能与这些信号通路密切相关。近研究显示炎症与炎症因子与AF 的发生、维持关系紧密，桑翠［24］通过临床研究发现，Th17 细胞响应IL-23 刺激产生的IL-17能诱导和介导炎症的发生，参与了永久性房颤的病理过程。成晨等［25］从选取的384 名孤立性房颤患者中发现了NPPA 突变基因p.Ile138Thr，为确定该突变基因能诱导房颤，进行了大鼠实验，发现突变基因通过激活多个途径，包括TNF 信号通路、NF-κB通路和nod 样通路，TNF 通路和NF-κB 通路能激活IL-1β 基因，导致免疫反应和炎症，最终导致房颤。钙信号通路［26］能调控许多细胞的功能，张菀桐等［27］通过大鼠实验，发现稳心颗粒能调控Cav1.2-CaM-CaMKⅡ信号通路，减轻房颤大鼠心肌细胞钙超载，恢复钙稳态，从而治疗房颤。

综上，本研究初步揭示了人参-甘松药对通过多种靶点、多种成分、多种功能与信号通路协同发挥治疗阵发性房颤的作用，除已报道的文献，仍有部分研究结果需要进一步实验证实，共同探讨药物的作用机制，为临床提供理论依据。