大山楂片薄层色谱鉴别方法的改进

刘立辉，常 华，周艳林，钟小清，吕高荣，邹 准，邹节明

（桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林 541004）

大山楂片是桂林三金药业股份有限公司拥有的独家中成药品种，其原药品标准收载于国家药品标准[1]。本品具有开胃消食的功能，用于食积内停所致的食欲不振，消化不良，脘腹胀闷。处方为山楂540 g、六神曲（麸炒）81 g、炒麦芽81 g。制法为以上三味，取山楂、炒麦芽各72.5 g，粉碎成细粉；其余山楂、炒麦芽和六神曲加水煎煮二次，每次1 h，滤过，滤液浓缩至相对密度1.12 ～ 1.16（60 ℃）的清膏，加入上述细粉及滑石粉17 g、硬脂酸镁5.7 g，蔗糖粉适量，混匀，制成颗粒，干燥，压制成1000片，即得。本品为淡棕色的片，味酸、甜。

近期，本公司在本品种的检验中发现按照原药品标准【鉴别】项下的方法处理，山楂对照药材溶液难以检出与熊果酸对照品溶液和大山楂片供试品溶液相应的紫红色斑点。因此，本研究对山楂对照药材溶液的制备方法进行了改进，并改进了展开剂、点样量等色谱条件，最终使山楂对照药材溶液能清晰地检测出熊果酸的紫红色斑点，且斑点显色清晰，分离度好，阴性样品无干扰，并使大山楂片供试品溶液的紫红色斑点的Rf值与山楂对照药材溶液、熊果酸对照品溶液的紫红色斑点的Rf值一致，使本品种的药品标准得到进一步的提高和优化。

1 仪器与试药

1.1 仪器

REPROSTAR3薄层成像系统（CAMAG公司）；Wincats工作软件（CAMAG公司）；S7540-12（T）超声波清洗器[必能信超声（上海）有限公司]；XP205电子分析天平（METTLER TOLEDO公司，d=0.01 mg）；XP404S电子分析天平（METTLER TOLEDO公司，d=0.1 mg）；P-1型薄层色谱展开缸（上海信谊仪器厂有限公司）；硅胶G薄层预制板（青岛海洋化工有限公司，批号：20150129，规格：100 mm×100 mm）；硅胶G薄层预制板（德国默克公司，批号：HX247632，规格：100 mm×100 mm）；硅胶G薄层预制板（国药集团化学试剂有限公司，批号：20140212，规格：100 mm×100 mm）；YOKO-XR薄层显色加热器（武汉药科新技术开发有限公司）；药品稳定性试验箱（重庆市永生实验仪器厂）。

1.2 试药

熊果酸对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，含量以99.3 %计，批号：110742-201220）；山楂对照药材（中国食品药品检定研究院，供薄层鉴别用，批号：121626-201402）；大山楂片（桂林三金药业股份有限公司，批号：140501，160601，160602，160603）；缺山楂大山楂片阴性样品（桂林三金药业股份有限公司）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取大山楂片6片，研细，加乙醚30 ml，超声处理10 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣用石油醚（30～60 ℃）浸泡2次，每次5 ml（浸泡约0.5 min），倾去石油醚，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为大山楂片供试品溶液。

2.1.2 原标准对照药材溶液的制备 取山楂对照药材3 g，加水适量，煎煮约30 min，滤过，滤液加乙醚30 ml提取，分取乙醚液，挥干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为山楂对照药材溶液。

2.1.3 改进的对照药材溶液的制备 取山楂对照药材1 g，按“2.1.1”项下方法制成山楂对照药材溶液。

2.1.4 原标准对照品溶液的制备 取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为熊果酸对照品溶液。

2.1.5 改进的对照品溶液的制备 取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 ml含0.4 mg的溶液，作为熊果酸对照品溶液。

2.1.6 阴性样品溶液的制备 按本品处方和工艺，不加山楂制成缺山楂的大山楂片阴性样品，按“2.1.1”项下方法制成缺山楂的大山楂片阴性样品溶液。

2.2 原标准的薄层鉴别方法

按照《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法[2]，吸取大山楂片供试品溶液与山楂对照药材溶液各6 μl、熊果酸对照品溶液1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮（13:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点。结果见图1。由图1可见，山楂对照药材溶液在和熊果酸对照品溶液相应的位置上，并没有显示相同的紫红色斑点，且大山楂片供试品溶液的点样量明显过载，紫红色斑点出现严重拖尾现象。试验结果与大山楂片原药品标准【鉴别】项下描述的“供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点”有差异。

图1 原标准薄层鉴别方法的色谱图

2.3 改进的薄层鉴别方法

同法，吸取大山楂片供试品溶液、山楂对照药材溶液与缺山楂的大山楂片阴性样品溶液各1～3 μl、熊果酸对照品溶液1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:5:8:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与山楂对照药材色谱和熊果酸对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，且斑点清晰，分离度好，Rf值一致，而阴性样品无干扰，说明该薄层色谱鉴别方法专属性强，重复性好。结果见图2。

图2 改进的薄层鉴别方法的色谱图

2.4 改进的薄层鉴别方法的耐用性考察

2.4.1 不同品牌硅胶G薄层预制板的考察 按照改进的薄层鉴别方法，对3个不同品牌的硅胶G薄层预制板（德国默克公司、青岛海洋化工有限公司、国药集团化学试剂有限公司）进行了考察。结果在3个不同品牌的硅胶G薄层预制板上，供试品色谱中，在与山楂对照药材色谱和熊果酸对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，且斑点清晰，分离度好，Rf值一致，而阴性样品无干扰，表明不同品牌的硅胶G薄层预制板对改进的薄层鉴别方法无明显影响，结果见图3。

图3 不同品牌薄层预制板的考察

2.4.2 不同温度的考察 按照改进的薄层鉴别方法，对低温（8 ℃）、高温（35 ℃）进行了考察。结果展开温度为低温（8 ℃）、高温（35 ℃）时，供试品色谱中，在与山楂对照药材色谱和熊果酸对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，且斑点清晰，分离度好，Rf值一致，而阴性样品无干扰，表明不同温度的展开条件对改进的薄层鉴别方法无明显影响，结果见图4。

图4 不同温度的考察

2.4.3 不同湿度的考察 按照改进的薄层鉴别方法，对低湿（32 %）、高湿（88 %）进行了考察。结果展开湿度为低湿（32 %）、高湿（88 %）时，供试品色谱中，在与山楂对照药材色谱和熊果酸对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，且斑点清晰，分离度好，Rf值一致，而阴性样品无干扰，表明不同湿度的展开条件对改进的薄层鉴别方法无明显影响，结果见图5。

图5 不同湿度的考察

3 讨论

薄层色谱法（TLC）具有成本低、分析时间短、结果直观性强等优点，目前仍广泛应用于中药的定性鉴别分析中。其使用关键点在于对样品的前处理、展开剂、点样量等的选择。因此，研究者应根据不同药品的具体处方适当调整薄层色谱鉴别的条件，以便获得良好的鉴别分析效果[3-8]。

本研究中，原标准薄层鉴别方法的山楂对照药材溶液的色谱中，在与熊果酸对照品色谱和大山楂片供试品色谱相应的位置上，并没有显相同的紫红色斑点。而改进的鉴别方法的山楂对照药材溶液的色谱中，在与熊果酸对照品色谱和大山楂片供试品色谱相应的位置上，却能显相同的紫红色斑点。经分析，系因原标准薄层鉴别方法的山楂对照药材溶液仅参照了大山楂片的部分制备工艺采用水煎煮处理，未能有效提出脂溶性成分熊果酸所致。而改进后的薄层鉴别方法的山楂对照药材溶液完全参照大山楂片供试品溶液的制备方法采用乙醚超声处理，则可以提取并检测出熊果酸的紫红色斑点。因此，山楂对照药材溶液的制备方法应改进为按照大山楂片供试品溶液的制备方法同法制备。

本研究中，按照原标准薄层鉴别方法的色谱条件操作，供试品色谱中熊果酸斑点的Rf值与山楂对照药材色谱、熊果酸对照品色谱斑点的Rf值不完全一致，主要是因为原标准薄层鉴别方法的展开剂欠佳，以及大山楂片供试品溶液、山楂对照药材溶液的点样量和熊果酸对照品溶液的浓度选择不当，造成点样量严重过载出现拖尾现象。因此，本研究对其色谱条件进行了改进，选择熊果酸薄层色谱鉴别常用的展开剂：环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20:5:8:0.1）[9]代替原标准采用的展开剂：三氯甲烷-丙酮（13:1），并将大山楂片供试品溶液、山楂对照药材溶液的点样量改进为1～3 μl，将熊果酸对照品溶液的浓度改进为每1 ml含0.4 mg，则解决了熊果酸斑点的拖尾现象问题，使供试品色谱中熊果酸斑点的Rf值与山楂对照药材色谱、熊果酸对照品色谱斑点的Rf值一致。

本研究改进了大山楂片的对照药材的制备方法，使其与供试品溶液的处理方法一致，可以提取并检测出熊果酸的紫红色斑点，并改进了展开剂、点样量和熊果酸对照品溶液的浓度。改进的大山楂片的薄层色谱鉴别方法比原方法更加科学、合理、完善，并符合质量控制要求，可替代原标准用于大山楂片的薄层色谱鉴别。