非小细胞肺癌患者调强放疗后Treg/Th17平衡改变与放疗效果、预后的关系

孟宪宇 张 萍 侯永杰

肺癌早期常无明显症状，多数患者诊断即为晚期，因此患者病死率高，预后较差，且易复发转移[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80%以上，是最常见的肺癌组织学类型[2]。调强放疗(intensity modulated radiotherapy，IMRT)为三维适应性放疗的一种，在增加靶区照射剂量的同时减少对正常组织的放疗剂量，能够有效提升肿瘤控制率，减轻正常组织的损伤[3]，但放疗效果及预后受多种因素影响，难以评估。近年来Treg/Th17比例失衡在多种疾病中作为预后指标而被报道[4]。研究表明CD4+淋巴细胞亚群在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用[5]，其分化形成的辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)在机体免疫过程中发挥调节作用[6]。Th17细胞能够特异性分泌白介素17(IL-17)和白介素23(IL-23)，在肿瘤中发挥促血管生成和促进肿瘤细胞浸润转移的作用[7]。Treg细胞分泌的TGF-β、IL-10等细胞因子能进一步促进肿瘤免疫逃逸的发生[8]，且Treg/Th17平衡常发生改变。有研究表明肿瘤患者Treg/Th17平衡改变与治疗效果及预后密切相关[9]，但该研究针对NSCLC的报道较少。本研究探讨NSCLC患者接受IMRT治疗后Treg/Th17及细胞因子IL-10、TGF-β、IL-17、IL-23水平与放疗效果及预后的关系，旨在为NSCLC放疗效果及预后评估提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选择本院胸外科2014年5月至2017年5月收治的80例晚期非小细胞肺癌患者作为研究组，其中男性48例，女性32例，年龄40～76(56.48±8.67)岁。纳入标准：①所有患者通过组织学检查确诊为NSCLC[10]。②患者在确诊前未进行化疗、放疗、靶向治疗和生物免疫治疗。③患者各脏器功能良好，无放疗禁忌证。④患者临床资料完整，包括年龄、性别、病理分级、肿瘤直径等。排除标准：①经诊断为CPOD、慢性肺部疾病、自身免疫病等非NSCLC患者。②出现脏器功能异常无法耐受放疗的患者和出现严重并发症的患者。③诊断后未在我院接受治疗的患者。另选取同期在我院体检健康人80例作为对照组。对照组中男性44例，女性36例，年龄43～72(55.37±7.49)岁。该研究纳入对象均签署对研究的知情同意书并经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 流式细胞术检测患者Th17、Treg细胞水平

无菌抽取对照组和放疗前后NSCLC患者静脉血5 ml于肝素抗凝管中，分离外周血中单个核细胞与12孔板中培养。加入佛波酯和离子霉素继续培养1 h后加入高尔基体抑制剂，培养4 h后收集细胞，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞。用PE标记的CD8单抗和FITC标记的CD3单抗对Th17细胞进行染色，之后进行固定和破膜，再用APC标记的IL-17A进行标记；用FITC标记的CD4单抗和PE标记的CD25单抗对Treg细胞进行染色，固定破膜后使用APC标记的Foxp3单抗进行标记，所有抗体均购买自美国BD公司。用Beckman公司流式细胞仪进行检测，CD3+、CD8-、IL-17A+者为Th17细胞，而CD4+、CD25+、Foxp3+者为Treg细胞。

1.3 ELISA法检测患者相关细胞因子表达水平

采用酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测对照组和放疗前后NSCLC患者血清中白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、转化生长因子-β(transformipg growth factor-β，TGF-β)、白介素-17(Interleukin-17，IL-17)、白介素-23(Interleukin-23，IL-23)的水平。抽取患者静脉血制备血清，使用ELISA试剂盒(上海酶联生物公司)检测患者血清细胞因子表达水平。使用酶标仪检测浓度，与标准曲线对比得出结果。

1.4 患者放疗方法及效果随访

所有患者均采用调强放疗(IMRT)，患者取仰卧位，常规分割照射剂量每次2 Gy，总剂量50～60 Gy，心脏限制剂量V30≤40%。患者均在肿瘤出现进一步发展时停止治疗，对患者瘤体大小进行测量并根据WHO实体瘤客观疗效评定标准[8]进行评价，疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)和疾病进展(PD)。随访采用门诊、电话等方式，随访间隔3个月，末次随访时间为2019年5月。患者随访期间无疾病进展、复发、转移和死亡者定义为预后良好，未及以上标准者定义为预后不良。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 2组Treg/Th17及细胞因子水平比较

研究组外周血中Th17、Treg细胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值显著高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 2组Treg/Th17及细胞因子水平比较

2.2 NSCLC患者放疗前后Treg/Th17及细胞因子水平比较

放疗后NSCLC患者外周血Th17、Treg细胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值显著低于放疗前，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表2。

表2 NSCLC患者放疗前后Treg/Th17及细胞因子水平比较

2.3 放疗后不同效果组患者Treg/Th17及细胞因子水平比较

80例NSCLC患者放疗后获得CR 12例、PR 23例、SD 27例、PD 18例。CR组、PR组、SD组患者外周血Th17、Treg细胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值显著低于PD组，差异具有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 放疗后不同效果组Treg/Th17及细胞因子水平比较

2.4 Treg/Th17及细胞因子水平与患者预后的关系

随访结束时失访3例，预后较好患者47例，预后不良患者30例。预后较好患者外周血Th17、Treg细胞水平，血清中IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平及Treg/Th17比值显著低于预后不良患者，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 Treg/Th17及细胞因子水平与患者预后的关系

3 讨论

肺癌是最常见恶性肿瘤，发病率和死亡率逐年上升，易复发和转移，患者5年生存率低，严重威胁人类健康[11]。目前对于NSCLC的治疗主要以化疗为主，但放疗在NSCLC的治疗中也十分重要。调强放疗(IMRT)是通过调节射线强度对肿瘤进行精准放疗的方法，可根据肿瘤大小和放射剂量进行调节，提高肿瘤照射剂量的同时减少对周围组织的损伤，是目前临床常用的放疗方式[12]。

肿瘤的发生发展与机体免疫密切相关，体内一些免疫细胞及相关细胞因子水平的变化能对肿瘤治疗效果和预后进行反馈[13]。CD4+T淋巴细胞是人体内主要的免疫细胞，研究表明其可在特定条件下分化成为辅助性T细胞17(Th17)和调节性T淋巴细胞(Treg)调节机体免疫功能[14]。Th17是近年来发现的一种新发现的T淋巴细胞亚群，主要通过分泌特异性细胞因子IL-17发挥生物学效应，Th17在机体维持免疫稳态中发挥重要作用，但也和许多疾病的发生发展密切相关[15]。有研究表明IL-17能够通过促进肿瘤微血管生成，增加肿瘤内微血管的数量和密度，促进肿瘤的增殖和转移[16]，在胃癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤中均发现Th17及其效应分子IL-17的高表达[17]。Treg是一种免疫调节细胞，其主要效应分子为TGF-β和IL-10。IL-10是炎症反应中重要的细胞因子，由淋巴细胞释放参与机体免疫调节。研究表明IL-10能够发挥免疫抑制作用，其表达水平升高常与肿瘤患者预后不良相关[18]。而TGF-β具有抑制抗肿瘤免疫、促进肿瘤侵袭和转移的作用[19]。Treg还通过抑制多种效应T细胞的增殖和活化维持免疫稳态[20]。在许多肿瘤患者体内Treg水平升高，抑制T细胞的作用，在诱导肿瘤免疫耐受的过程中发挥重要作用[21]。学者Yang等[22]发现Treg/Th17平衡在维持免疫稳态过程中十分重要。Treg/Th17平衡改变与多种疾病相关，平衡倾向Treg时有利于多种肿瘤的生长和转移，这种改变在胃癌及宫颈癌患者体内均被发现[23]，但与NSCLC相关研究较少。

本研究发现NSCLC患者血清IL-17、IL-23、TGF-β、IL-10水平，Treg、Th17细胞水平和Treg/Th17均高于正常人，提示NSCLC的发病与Treg/Th17平衡倾向Treg有关。IMRT治疗后NSCLC患者上述指标较化疗前均下降，说明IMRT治疗能够改善NSCLC患者Treg/Th17平衡倾向Treg。接受IMRT治疗的患者CR组、PR组、SD组与PD组相比上述指标均明显下降，提示改善Treg/Th17平衡改变与患者放疗效果相关。预后较好的患者上述指标显著低于预后不良患者，提示改善Treg/Th17平衡改变与患者预后相关。

综上所述，NSCLC患者Treg/Th17平衡改变与患者化疗效果和预后相关，改善NSCLC患者Treg/Th17平衡改变可以提升放疗效果，改善患者预后。Th17/Treg平衡一定程度上参与了NSCLC的发生发展和预后，但在NSCLC中发挥的具体作用仍需进一步探究。