自噬相关蛋白Atg5和Beclin-1在宫颈癌组织中的表达及与临床病理的相关性

薛小芳 岳会珠 何涯丽

宫颈癌是当前妇科中最常见的1种恶性肿瘤，发病率为世界的第二位。30～35岁发病率最高，而50～55岁浸润性癌的发病率最高[1]。早期宫颈癌患者治疗效果比较好，而且5年生存率比较高，但是对于晚期宫颈癌患者来说，由于化疗敏感性差，所以降低了患者的生存率。因此，需要更多分子生物学指标来判断宫颈癌患者对不同治疗的反应及恶性程度。自噬是一种细胞内的大量降解系统，起着各种生理作用，如发育、分化和维持细胞内稳态。自噬功能障碍与严重疾病有关，包括肌病、神经退行性疾病和癌症。这个多步骤的过程是由一组进化上保守的称为自噬相关蛋白(Atg)的蛋白质来完成的[2]。Beclin-1是酵母Atg6的哺乳动物同源体，是自噬的关键介质。它与调节自噬的多种共因子相互作用，其功能障碍与许多疾病有关，包括许多类型的人类癌症。自噬的诱导是由称为自噬体的双膜结构的形成开始的。自噬体包裹着细胞器和微生物等物质，并与降解这些物质的溶酶体融合。形成自噬体包括一个泛素样的共轭系统，其中Atg5与Atg12共价结合。Atg5是共价修饰系统所必需的，对自噬的发生至关重要。最近的证据表明，自噬可能在宫颈癌的发生和发展中起重要作用[3-4]。因此本文选取我院2017年6月至2020年6月共收治的60例宫颈癌患者作为研究对象，探讨自噬相关基因5(Atg5)及Beclin-1两种蛋白在宫颈癌组织中的表达及与临床病理的相关性，具体报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2017年6月至2020年6月共收治的60例宫颈癌患者作为研究对象，将其分为恶性组。入选标准：所有患者经过病理学检查确诊为宫颈癌；在术前未经免疫治疗、化疗以及放疗等；无手术禁忌症，具备手术指征；所有患者对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：存在严重脏器功能障碍的患者；不能配合随访的患者；合并其他恶性肿瘤的患者。其中恶性组患者年龄41～68岁，平均年龄(56.22±3.51)岁；平均病程(12.22±1.24)个月。取同期60例良性子宫肌瘤或子宫腺肌瘤行全子宫切除手术的患者作为良性组，另取同期60例健康者的子宫颈组织标本进行分析，将其分为对照组。其中良性组患者中年龄45～69岁，平均年龄(55.34±4.55)岁；平均病程(12.44±1.35)个月。对照组患者年龄42～70岁，平均年龄(54.45±3.61)三组患者一般资料对比无显著差异(P>0.05)。

1.2 方法

免疫组织化学法：将收集的标本在冰上进行石蜡包埋，注意尽量将所有组织覆盖，然后放入-20 ℃冰箱20～30 min，设置切片机3 μm，连续切片，认真选取形态较好、组织完整的切片放到35 ℃温水中，等到切片完全展平后收于防脱载玻片上，晾干后置于玻片架上，放入烤箱，调节烤箱温度为65 ℃，烘烤2 h。

总RNA提取：从零下80 ℃的冰箱中取出不同类型的宫颈癌组织，将100 mg组织放入研钵之中加入氮液研磨，最后磨成粉末，加入BufferRLT1 ml进行反复的吹打，让样品能够充分的裂解，并在室温5 min等待核酸蛋白复合物分离，之后按照说明严格步骤提取RNA，并进行逆转录合成cDNA。

免疫组化结果判定：应用半定量计分法，细胞核内和细胞质出现棕黄色颗粒，判定为阳性。并依照切片之中细胞染色强度与阳性细胞总数分析。其中阳性着色重度为3分，中度为2分，轻度为1分，背景清晰无色为0分。阳性细胞数量>75%为3分，25%～75%为2分，<25%为1分。总分计3～6分为阳性[5]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 三组患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA的表达情况对比分析

三组患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表达情况对比差异显著，恶性组明显低于良性组和对照组(P<0.05)，如表1所示。

表1 三组患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA的表达情况对比分析

2.2 三组患者Atg5和Beclin1蛋白表达阳性率对比分析

三组患者Atg5阳性与阴性患者例数对比差异显著(P<0.05)，Beclin1阳性与阴性患者例数对比差异显著(P<0.05)，如表2所示。

表2 三组患者Atg5和Beclin1蛋白表达阳性率对比分析(例，%)

2.3 60例宫颈癌患者Atg5和Beclin1阳性与阴性患者临床病理特征对比分析

60例宫颈癌患者中，Atg5阳性与Atg5阴性患者月经状态、年龄、肿瘤大小对比无明显差异(P>0.05)，两组患者的临床分期、淋巴结转移、组织分化程度对比差异显著(P<0.05)，Beclin1阳性与Beclin1阴性患者月经状态、年龄、肿瘤大小对比无明显差异(P>0.05)，两组患者的临床分期、淋巴结转移、组织分化程度对比差异显著(P<0.05)，如表3所示。

表3 60例宫颈癌患者Atg5和Beclin1阳性与阴性患者临床病理特征对比分析/例

2.4 自噬相关基因Atg5和Beclin1与宫颈癌病理相关性分析

Spearman相关分析显示，月经状态、年龄、肿瘤大小与自噬相关基因Beclin1和Atg5不相关(P>0.05)，临床分期、淋巴结转移和组织分化程度与自噬相关基因Beclin1和Atg5呈负相关(P<0.05)，如表4所示。

表4 自噬相关基因Atg5和Beclin1与宫颈癌病理相关性分析

3 讨论

自噬属于1种细胞维持自身内环境稳定的手段，一旦人体内自噬功能出现异常，可以导致细胞出现异常增生情况，严重者会出现癌变现象。因此深入了解细胞的自噬功能与肿瘤细胞的自噬功能，能够判断肿瘤患者的预后情况，并研究出针对于肿瘤治疗的有效药物[6]。Beclin1又称BECN1基因，属于自噬启动的关键蛋白，其主要作用于细胞自噬成核时期。相关研究表明[7-8]，Beclin1表达在人类的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌之中分别下降了75%、50%和40%。Atg5位于人体染色体q21，编码276个氨基酸，在自噬相关基因Atg严格调控自噬的过程中起到关键作用，At95首先与At912结合，形成的At95．At912泛素样连接系统连接到外膜，自噬体膜延伸，进而形成自噬体，在巨噬细胞中因缺少At95而导致吞噬体不能与溶酶体相互融合。相关研究表明[9]，Atg5与很多肿瘤的发展与发生存在关系，在卵巢癌、结肠癌和胃癌组织中Atg5基因的蛋白表达情况降低。

本研究结果显示，三组患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表达情况对比差异显著，恶性组明显低于良性组和对照组(P<0.05)，由此可以发现宫颈癌患者的Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表达情况降低，因此可以说明Atg5及Beclin-1 可能参与宫颈癌的发生与发展。相关研究表明[10]，Beclin1在膀胱癌组织之中的表达量明显低于正常膀胱组织，而且在膀胱癌的发展与发生过程中具有重要作用。还有研究表明[11]，Atg5低表达患者3年生存率明显更低，与本研究具有相关性；三组患者Atg5阳性与阴性患者人数对比差异显著(P<0.05)，Beclin1阳性与阴性患者人数对比差异显著(P<0.05)，由此证明，Atg5 和Beclin1在宫颈癌患者的阳性表达患者少于良性肿瘤组织和健康者，Atg5 和Beclin1的表达水平也就越低。由此可推测，Beclin1在宫颈上皮细胞发生病变开始，会出现功能缺陷，这可能是因为肿瘤细胞的其他抑癌基因出现相互作用，从而导致Beclin1表达出现异常，对细胞的自噬功能产生抑制作用，从而导致其细胞恶性开始增殖，具体生物学通路还需要更多的细胞学实验和动物实验进行验证[12]；60例宫颈癌患者中，Atg5阳性与Atg5阴性患者月经状态、年龄、肿瘤大小对比无明显差异(P>0.05)，两组患者的临床分期、淋巴结转移、组织分化程度对比差异显著(P<0.05)，Beclin1阳性与Beclin1阴性患者月经状态、年龄、肿瘤大小对比无明显差异(P>0.05)，两组患者的临床分期、淋巴结转移、组织分化程度对比差异显著(P<0.05)；Spearman相关分析显示，月经状态、年龄、肿瘤大小与自噬相关基因Beclin1和Atg5不相关(P>0.05)，临床分期、淋巴结转移和组织分化程度与自噬相关基因Beclin1和Atg5呈负相关(P<0.05)，临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移以及肿瘤分化程度是体现肿瘤恶性程度的临床病理指标，对于宫颈癌患者具有重要的预测作用，因此本文以这三个指标来分析Beclin1和Atg5与病理的相关性。相关研究者对上皮性卵巢癌组织中Beclin1表达及相关性研究发现，患者的临床分期、淋巴结转移情况与其明显相关[13]。还有研究者发现[14-15]，Atg5在宫颈癌患者中呈现高表达，属于宫颈癌的预后独立因素，但是。一些自噬标记物在人类癌中的表达改变已经被报道，似乎表达减少和过度表达都可能发生。虽然，对单独Beclin1和Atg5在癌症中的表达研究比较多，但是对两者一起的研究甚少，但是可能本研究中病例数过少，还存在一定局限性，所以还需后续更深入的研究。

综上所述，自噬相关基因5(Atg5)及Beclin-1两种蛋白在宫颈癌患者的癌组织中表达低于良性肿瘤患者和健康人士，随着患者病情加重，自噬相关基因5(Atg5)及Beclin-1两种蛋白表达明显降低，自噬相关基因5(Atg5)及Beclin-1与宫颈癌患者的临床分期、淋巴结转移和组织分化程度呈负相关，因此可以应用自噬相关基因5(Atg5)及Beclin1来判断宫颈癌患者病情的严重程度。