基于网络药理学方法研究紫草对癌症疾病的作用机制＊

钱薇 褚明亮

癌症为世界第二大死亡原因，其死亡率和发病率逐年攀升。临床治疗癌症大多以手术治疗和放化疗为主，其预后大多较差，存在生存率低、复发率高、多并发症等一系列问题[1-2]。紫草是紫草科紫草属植物，其功效为凉血活血、解毒透疹[3-4]。现代中医认为痰浊较盛、结聚成块为肿瘤的病因所在，紫草可凉血活血使热毒痈疡散去以达到其疗效。现代药理研究发现紫草可通过诱导细胞程序性凋亡、调节细胞通路活性、诱导ROS、抑制血管生成等方面抑制癌细胞生长繁殖[5]。但其药效物质基础及机制少有报道。因此该研究将在网络药理学的基础上分析紫草的抗癌作用机制，为其运用于临床提供更多的研究思路。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库

UniProt数据 库（https：//www.uniprot.org/）， 中药系统药理学分析平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php），DrugBank数 据 库（http：//www.drugbank.ca/），Cyto-scape 3.7.1 软 件（https：//cytoscape.org/），GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/），String数 据 库（https：//stringdb.org/），Metascape数 据 库（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。

1.2 紫草活性成分和靶点筛选

在TCMSP数据库中收集紫草的化学成分，时间截至2021年1月。并以类药性（drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%为条件筛选紫草的有效活性化合物，利用UniProt数据库除去非人源基因，把相应靶点蛋白名称转化为对应的靶点的Uniprot ID。

1.3 紫草活性成分-靶点网络的构建

通过TCMSP数据库收集“1.2”项下紫草中的活性成分的对应靶点，利用Cyto-scape 3.7.1软件构建活性成分-靶点网络图。

1.4 癌症靶点信息的筛选

在GeneCards数据库中输入“cancer”为疾病名称，使Relevance score≥12.43进行筛选，得到GeneCards数据库癌症相关靶点信息；并把“cancer”疾病关键词输入DrugBank数据库中进行搜索，得到DrugBank数据库癌症相关靶点信息。将以上两个数据库筛选后获得的靶点信息进行合并。把Uniprot ID不具有的靶点去除，把相同Uniprot ID的不同靶点删除，保留Uniprot ID的唯一靶点。利用在线韦恩将紫草的主要活性成分的预测靶点与癌症相关靶点进行交集分析并绘制韦恩图，提取紫草和癌症疾病的交集靶点。

1.5 癌症与紫草对共同靶点的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction network，PPI）关系

将癌症与紫草素的交集靶点导入STRING平台，选取>0.700作为蛋白之间相互作用的信度依据，隐藏散在的节点，最终得到癌症与紫草对共同靶点的蛋白质-蛋白质互作PPI图。将筛选得到的互作靶点输入Metascape数据库，在数据库中完成KEGG通路富集。

1.6 紫草抗癌活性成分-靶点-KEGG通路网络图构建

利用Cyto-scape 3.7.1软件，在“1.3”项紫草活性成分-靶点网络的基础上连接各基因信号通路，构建“紫草抗癌活性成分-靶点-KEGG通路”网络图。

2 结果

2.1 紫草活性成分、靶点筛选及网络的构建

利用TCMSP数据库收集到紫草中包含51个活性成分，经过筛选得到10个主要活性成分，见表1。对10个活性成分的对应靶点进行收集，共获得83个药物相关靶点。利用UniProt数据库检索83个靶点蛋白的对应基因名并进行标准化检索，去除暂无对应基因名称的蛋白和10个主要活性成分重复的蛋白，最后共获得69个药物靶点蛋白对应基因，见图1。

图1 紫草活性成分-靶点图

表1 紫草的10个活性化合物及其参数信息

2.2 紫草药物靶点-癌症靶点网络构建

通过GeneCards数据库中共获得25 466个与癌症相关的基因和靶点信息，经Relevance score≥12.43筛选后获得1 597个与癌症相关的基因和靶点信息。后在DrugBank数据库中收集了125个与癌症相关的基因和靶点信息。将两个数据库的基因合并后除去46个重复基因，共获得1 672个与癌症相关的基因和靶点信息。运用UniProt数据库对83个紫草药物靶点蛋白和1 672个癌症相关所得蛋白靶点数据进行标准化，通过在线韦恩获得紫草药物靶点与癌症疾病靶点共有靶点15个（见图2小椭圆形节点）。

利用Cyto-scape 3.7.1软件构建紫草活性成分靶点和癌症靶点网络数据图，见图2。显示共22个节点和44条边。其中八边形节点（ZC）代表紫草，大椭圆形节点（cancer）代表癌症疾病，5个三角形节点代表有效活性成分，小椭圆形节点代表15个目标靶点节点，黑色的线条代表有效活性成分与目标靶点之间相互作用关系。网络图中的节点的度值表现其与其他节点的相连性，节点的度值于节点的关键性呈正比。其中1-甲氧基乙酰紫草素（MOL007714）的度值（degree）最高，为10。

图2 紫草活性成分靶点和癌症靶点网络据图

2.3 癌症疾病与紫草对共同靶点的PPI分析

将15个癌症-药物共同靶点上传至STRING数据库，并设置高等置信度蛋白参数评分值>0.700，获取相应蛋白互相作用信息。网络中共包含15个节点，40条边，平均节点度值5.33。将网络信息TSV数据格式导入Cyto-scape 3.7.1软件构建各蛋白互相作用的PPI网络后，进行拓扑分析，其中ESR1、AR、PGR等基因的节点度值>8，明显高于其他靶点，见图3。

图3 紫草治疗癌症疾病靶点蛋白互作PPI图

2.4 紫草治疗癌症疾病互作靶点KEGG通路分析

通过KEGG通路分析，共获得10条信号通路，见表2。使用Cyto-scape 3.7.1软件，在“2.3”项紫草活性成分靶点和癌症靶点网络图（图2）基础上连接各基因信号通路，构建出“紫草抗癌活性成分-靶点-KEGG通路”网络图（图4）。从网络图中可以发现紫草的5个活性成分与12个靶点及10条通路之间有密切的相互关联作用。筛选出其中靶点数较多的两条通路，分别为癌症通路（pathways in cancer）和雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）。

图4 “活性成分-靶点-KEGG通路”网络图

表2 紫草治疗靶点相关通路信息

3 讨论

研究先通过TCMSP数据库挖掘，筛选得到紫草的10个有效活性成分，其中1-甲氧基乙酰紫草素、吡氟甲禾灵、甘露醇、谷甾醇和乙酰紫草素5种活性成分与癌症疾病关联度较高。特别是1-甲氧基乙酰紫草素和乙酰紫草素，两者均为萘醌类化合物，具有抗肿瘤等多种药理作用[5-9]。

PPI蛋白互作网络表明，AR、ESR1、PGR等基因的节点度值>8，明显高于其他靶点（图3），说明紫草抗癌的核心潜在靶点可能为上述靶点。AR是典型的雄激素受体，参与乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等肿瘤疾病的发生发展，并与其预后及相关治疗密切相关[10-13]。ESR1基因是ER家族中ERα类基因，雌激素通过与细胞内的ER受体结合发挥其各种功能。研究表明紫草就可以通过ESR1抑制雌激素信号通路中的ER受体表达，抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞的增殖[14]。PGR，也称为PR，为孕酮受体。PR和ER常常联合出现在乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等相关肿瘤疾病中，并共同作用调控肿瘤细胞的代谢、生长、侵袭和转移等[15-19]。

进一步的KEGG通路分析发现，紫草治疗癌症疾病是通过10条信号通路实现的（表2和图4）。而其中的癌症通路和雌激素信号通路与相关靶点的关系最为密切，分别为6个和5个（表2和图4），由此可推测紫草可能主要通过以上2条通路发挥抑制肿瘤作用的。

总之，该研究利用网络药理学对紫草进行了多成分、多靶点、多通路的探究。研究结果初步指明了紫草中的有效活性成分及重要靶点通路，为进一步的探究提供了良好的基础。