玉米叶夹角的遗传与分子调控研究进展

张全艳,张培高,徐春霞,丛一宁,刘丽*

(1.云南大学农学院，昆明 650504；2.云南省农业科学院粮食作物研究所，昆明 650205)

玉米(ZeamaysL.)是世界上广泛种植的作物，也是我国种植面积较大的粮食作物。高产是我国玉米育种的首要目标，提高单产是增加作物总产量的主要方式，加大种植密度是提高单产的重要方法，而选育株型紧凑的高产杂交种进行合理密植是提高玉米产量最经济有效的措施之一。Mock和Pearce[1]最早提出玉米理想株型及具体指标，随后理想株型育种成为玉米育种的重要研究方向，先后育成了一系列株型紧凑、耐密性强的玉米品种，使种植密度逐渐提高，单产水平不断提升。美国玉米主产区的种植密度在20世纪30年代仅为30 000株·hm-2，而目前已提升到90 000株·hm-2以上，耐密品种的选育和推广是美国玉米产量稳居世界前列的重要原因。随着耐密品种(先锋公司P1197YHR)的选育以及保护性耕作等栽培技术的应用，玉米创下了41 340 kg·hm-2的高产记录(美国国家玉米种植协会，National Corn Growers Association，NCGA)。我国掖单2号、掖单13号、DH3719、郑单958等耐密品种的成功选育为玉米高产育种提供了新途径，显著推动了我国现代玉米育种进步[3-4]。最近，Tian等[2]从玉米野生祖先种大刍草中克隆了控制玉米紧凑株型、密植增产的关键基因，建立了玉米紧凑株型的分子调控网络，揭示了玉米密植株型的分子调控机制。

耐密优良品种的选育是解决我国耕地面积减少与玉米供需矛盾的有效途径。叶夹角作为耐密品种的重要外在形态指标，直接决定了玉米在高密度种植条件下对避荫综合症的抵抗能力，对于改善群体冠层结构，增强光能的利用率，减小避荫综合症的诱发因素，促进光合产物在源、流、库之间的高效合理运转，增加光合产物的积累和提高产量具有重要的作用。本文从叶夹角对玉米株型、光合作用、种植密度与产量的影响，以及叶夹角的形态建成、遗传、分子调控机制、QTL定位与基因克隆研究等方面综述了叶夹角形成的分子机理和遗传研究进展，分析了当前研究存在的问题，并提出了未来玉米叶夹角研究的主要方向，为耐密理想株型分子标记辅助选择提供理论依据，在玉米高密度育种及株型育种中也具有重要的实际应用价值。

1 叶夹角对玉米生长发育的影响

1.1 叶夹角对玉米株型的影响

叶夹角即叶片与主茎之间的夹角，是决定玉米株型的主要因素[5]。根据叶夹角的差异，玉米株型分为平展型、紧凑型和中间型。平展型玉米植株高大、叶片宽大，穗位以上叶片与主茎之间的夹角大于45°，叶片平伸、顶尖下垂，单株生产潜力高，不耐密植；紧凑型玉米植株稍小、叶片窄小，穗位以上叶片与主茎之间的夹角小于30°，叶片直立向上，单株生产潜力低、耐密植，群体生产潜力高；中间型玉米介于紧凑型和平展型之间，穗位以上叶片与主茎之间的夹角在30°～45°之间。其中紧凑型玉米植株叶片直立向上，冠层截光能力低，群体透光率高，有利于中下部叶片获得更多光照，使叶片高效地利用光能，进而提高植株净光合速率和群体生产力，增加种植密度。最早培育出的耐密玉米杂交种先锋3306，其显著的特点是冠层叶片直立、与地面间的夹角逐渐增大，因此能够有效截获光合辐射[6-7]，进一步模拟试验和田间试验均表明，冠层叶片直立的杂交种都具有显著的产量优势，说明合理的叶片结构分布对冠层形态有重要决定作用。在高密度种植条件下，紧凑植株具有最大的光截获叶面积指数，能够有效地促进籽粒灌浆中的氮素积累，因此产量显著高于平展型植株。由于较小的叶夹角有利于降低冠层截光率，提高群体光能利用率和群体种植密度，从而提高产量，同时为了适应高密度的种植，叶夹角也变得更加直立[2]。当群体冠层随种植密度增加变得拥挤时，直立的叶子可以通过减少遮荫和保持光截获效率以最大限度地提高光合作用，实现高密度种植条件下的高产目标，因此较小的叶夹角是玉米育种最为重要的靶标。

1.2 叶夹角对玉米光合作用的影响

叶长、叶宽、叶夹角和叶片形态是决定玉米株型紧凑程度的主要性状，直接影响玉米群体冠层截光能力和群体光能利用率[6，8]。当叶面积指数最高，叶夹角接近90°时，光合作用最强，光能利用率最高。由于高产品种的株高较低、叶夹角较小、穗上叶较少，叶向值、叶面积指数和单位面积内种植群体数量较大，因此，在高密度种植条件下，中下层叶片也能获得光照，增加产量。黄收兵等[9]提出，株型紧凑、穗下叶层间距小、穗位低、叶夹角小等性状为理想株型，其具有冠层叶片排列紧密、透光率和光能利用率高等优势，因此有助于增加种植密度，提高产量。上述研究结果一致表明，减小叶夹角是构建理想株型、提高产量的重要途径之一。

1.3 叶夹角对玉米种植密度与产量的影响

叶夹角对玉米种植密度有重要决定作用。Pendleton等[7]比较C103×Hy组合近等基因系的产量差异，结果表明，携带liguleless2(lg2)基因的近等基因系叶片直立，具有较好的冠层结构以及较高的光能利用率，产量比其他近等基因系高41.2%，此外将平展型品种先锋3306改良为叶片直立的紧凑型品种，其光截获效率和产量均显著增加。随后Lambert和Johnson[6]用B14×h43和Oh43×R177的RILs比较普通重组系(叶夹角35°)、liguleless1(lg1)基因型和lg2基因型玉米的产量，结果表明，在75 000和90 000株·hm-2的高密度种植下，lg2基因型的产量显著高于普通重组系，说明叶夹角与玉米种植密度及产量密切相关。lg1基因型叶片直立，为高密度种植的理想株型，而lg2叶夹角较lg1大，但其光截获效率高，因此也具有较高的产量。李登海等[10]将平展型玉米叶片改造成紧凑型，产量增加21%，而将紧凑型品种改造成平展型，产量减少20%，并且紧凑型品种DH3719于2005年以105 000株·hm-2的种植密度创下了21 042 kg·hm-2的夏玉米高产纪录，较掖单13号1989年创造的16 444 kg·hm-2的世界夏玉米纪录超出4 584 kg·hm-2，将单产纪录提高了27.96%。近几十年玉米株型育种取得显著成效，与20世纪中早期育成品种相比，现代玉米杂交种叶片直立且叶面积较大，光截获效率增加了14%，增产20%左右。此外，Ku等[8]提出，叶面积指数大于3，上部叶片直立为玉米最佳株型组合类型。随着具有直立叶的自交系B73在杂交种选育中的广泛利用，玉米杂交种的叶夹角逐年下降，特别是34N44、P1197YHR等叶夹角小、耐密品种的成功选育及推广应用为玉米增产做出了重要贡献，说明减小叶夹角或降低叶向值是通过株型改良提高玉米产量的重要途径。

2 叶夹角的形成机制

2.1 叶夹角形态建成

叶片发育起始于茎顶端分生组织(stem apical meristem，SAM)周边的初始细胞，包括叶原基的形成和极性轴向的建立。叶原基由顶端分生组织中心“干细胞”在生长素诱导下形成成簇分布的外缘叶原初生细胞，然后在遗传背景和环境的互作效应下，叶原基建立基-顶轴(叶的基部-顶端)、腹-背轴(茎的近轴面-远轴面)、中-边轴(叶的主脉-边缘)3个极性轴向，该过程为叶片发育和形态建成的关键时期，其中叶夹角主要由叶片与叶鞘之间的叶环所调控，叶环包括叶舌与叶耳，其形成发生在基-顶轴的极性建立过程中[11]。叶夹角与叶耳及中脉的机械支撑强度有关[12]，因此，解析叶环发育基因的调控机制有助于从分子水平阐明叶夹角形成的遗传基础。

2.2 叶夹角遗传研究

叶夹角的广义和狭义遗传力均较高，并且以加性效应为主，同时受非加性效应的影响。蔡一林等[13]认为，叶夹角的遗传符合加性遗传模型，因此以加性效应为主，也有研究显示，叶夹角由多基因或多位点控制，并且受非加性基因的影响[5]。Chen等[14]采用GriffingⅡ双列杂交进行研究，发现叶夹角的遗传符合加性-显性-上位性模型。也有研究表明，叶夹角主要由加性效应和母本效应所决定。赖仲铭等[15]发现，在叶夹角遗传效应中，一般配合力作用较大，而特殊配合力的影响较小，说明玉米叶夹角的杂种优势不突出。综上所述，叶夹角的遗传效应以加性效应为主，但不同材料间由于遗传背景的影响，可能存在显性、上位性及母本效应，因此可通过遗传育种，选择叶夹角较小的植株，通过株型改良提高玉米产量。

3 叶夹角形成的分子调控机制

3.1 叶夹角形态发育的调控机制

近年来，国内外对玉米叶片形态发育相关基因的调控进行了较多研究。KNOX基因家族rs1位于顶端分生组织处，维持细胞分化，其中Knotted-1(Kn1)基因是首个从植物中发现的KNOX1亚基因家族，其与Knox7同属于KNOX家族，在顶端分生组织特异性表达，调控细胞分化向膨大生长的转变，形成特定的叶向，此外在基-顶轴的极性形成过程中，Kn1通常与lg3、lg4、Knox8相互作用进而调控叶片发育[16]。研究表明，KNOX还能促进细胞分裂素(CTK)合成基因上调表达，抑制GA3和GA20氧化酶合成，可以促进SAM细胞分裂形成叶原基，并且增加GA的含量有利于解除DELLA对叶片发育的抑制作用[16]。lg3和lg4基因半显性突变主要在叶鞘中表达，但是lg3隐性突变对叶片发育的影响较小，可能原因是lg3与KNOX基因家族存在一定的功能冗余[17]。此外，TCP家族的Wab1基因的显性突变会造成异位表达，导致叶舌缺失，进而影响基-顶轴极性的建立[18]。

lg1、lg2和lgn对叶舌及叶耳的发育具有调控作用。Johnston等[19]利用RNA-seq技术对突变体lg1和野生型的第六和第七叶原基、上部叶片及下部叶鞘进行比较，共检测到96个差异表达基因，其中34个差异表达基因在野生型中上调表达，而在lg1突变体中下调表达。进一步研究发现，在叶夹角的形态建成中，lg1基因首先激活PIN1a在叶环区的表达，调控生长素和叶片-鞘边界基因如CUC2和lg3之间相互作用，阻碍边界基因的细胞表达进而形成叶舌。在边界分化过程中，lg3与BEL14或BEL12对叶舌细胞分裂有互作效应，而PIN1a蛋白介导的生长素促进了边界细胞的分裂形成叶舌。最近，Tian等[2]克隆了两个控制玉米紧凑株型、密植增产的关键基因UPA1(uprightplantarchitecture1)和UPA2(uprightplantarchitecture2)，其中UPA2的功能变异是由于2 bp核苷酸插入/缺失，该插入/缺失为顺式调控元件的突变进而调控下游9.5 kb的B3转录因子ZmRAVL1的表达，UPA1主要调控BRs合成途径中brd1基因的表达。进一步功能分析发现，大刍草UPA2基因与玉米叶片发育基因DRL1的结合能力更强，而DRL1可与玉米无叶舌基因lg1互作进而抑制lg1对ZmRAVL1的激活，引起下游brd1基因的表达下调，从而降低叶环处内源BRs表达水平，影响叶耳细胞的增殖，最终形成较小的叶夹角。

3.2 叶夹角形成的激素调节机制

叶夹角的形态建成与植物激素特别是油菜素内酯(brassinosteroids,BRs)、生长素(auxin,IAA)和赤霉素(gibberellin,GA)密切相关。在玉米、水稻以及高粱中，国内外鉴定出大量的BRs合成、信号传递相关基因，其中参与BRs信号传导的基因突变体大多表现为叶夹角较小。Makarevitch等[20]研究油菜素内酯C-6氧化酶对玉米生长发育的影响发现，细胞色素P450家族Brd1基因的无义突变会影响BRs的合成，引起植株矮化、叶片呈波浪状扭曲、叶舌变小、叶耳增大，并且叶耳与叶片的边界消失，进而影响叶夹角的大小。Best等[21]鉴定出BRs合成途径的另一个基因na2，该基因突变同样影响BRs的合成，导致株高矮化、叶片形态化及叶夹角变大。此外，玉米2号染色体上qLA2的候选基因ZmILI1，通过与下游基因lg1的启动子结合后激活lg1的表达，从而调控叶夹角。此外ZmILI1和CYP90D1形成负调控，维持玉米中BRs的平衡[22]。通过RNAi干扰BRs受体的同源基因表达，转基因植株更绿、株型更紧凑且植株形态扭曲，叶舌与叶耳均变小。上述研究表明，BRs对叶夹角的形成具有重要调控作用。

IAA也参与调控玉米叶夹角的形成和发育，其作用机制较复杂。Moon等[23]通过生长素定向运输蛋白的荧光成像分析，发现生长素在叶片-叶鞘边界的叶舌形成部位累积，说明生长素与叶舌的形成有关。此外叶夹角基因LAZY1通过调节生长素的极性运输，进而影响细胞发育使叶夹角发生改变[24-25]。Fellner等[26]比较现代玉米品种3394与早期育成品种307对生长素的响应情况发现，现代品种3394的叶夹角更小，其对生长素敏感性减弱，因此品种的适应性性更强，主要原因是3394的叶夹角较小，生长素结合蛋白基因ABP4的表达量随之下降，因此对生长素的敏感性减弱。

赤霉素对叶夹角的形态建成有一定影响。Kong等[12]对自交系B73和986进行比较，从叶夹角较小的986中鉴定出7个与细胞分裂素(CK)降解相关基因、19个乙烯(ETH)和23个GA信号传导相关基因，这些基因调控细胞分裂并促进细胞的伸长，进而影响叶夹角的形成。Best等[21]研究表明，GA突变体、BRs突变体以及GA-BR双突变体与普通植株间株高、叶夹角、分蘖以及育性均存在显著差异，特别是两种激素的双突变体株型与育性均有较大差异，说明GA和BRs基因间的互作可能对叶夹角的形成有重要调控作用。

4 叶夹角的QTL定位与基因克隆研究

4.1 叶夹角的QTL定位研究

连锁分析和关联分析是研究农作物复杂数量性状的主要方法，国内外对玉米叶夹角相关QTL进行了大量的研究(表1)。Mickelson等[27]最早对叶夹角进行研究，用B73和Mo17构建重组自交系群体(RILs)，采用复合区间作图法在两个试点共检测到9个叶夹角QTL，其中位于第1和7号染色体上的主效QTL分别解释表型变异的20.6%和27.7%。Guo等[3]用10个不同自交系作为供体亲本，以农系531为受体亲本构建染色体片段导入系，鉴定出4个叶夹角发育相关QTL，其中位于第2、9及10号染色体上QTL分别解释了12.7%、14.1%和26.5%的表型变异。Tian等[5]利用5 000份RILs组成的巢式关联作图(nested association mapping，NAM)群体，在9个环境下进行表型鉴定，通过玉米全基因组关联分析，从160万个遗传位点鉴定叶舌基因的变异类型及叶夹角QTL/基因，共检测到30个叶夹角QTL，解释总遗传变异的74.8%。Li等[49]利用GBS(genotyping by-sequencing)简化测序技术分析3个RILs群体的基因型，在6个环境下对3个株型叶夹角相关性状进行分析，共检测到17个叶夹角QTL位点，能够解释表型变异的2.0%～11.4%。李威亚[43]以玉米大刍草渗入系BC2F5群体为研究材料，在第2染色体定位到两个叶夹角QTL(qLA2-1和qLA2-2)，分别解释表型变异的9.2%和10.9%，进一步研究发现，这两个叶夹角QTL来自大刍草。郭书磊等[50]利用Meta-QTL统计方法对不同实验、不同群体的株型相关QTL进行整合，在已报道的592个QTL中，鉴定出17个一致性叶夹角QTL，显著缩小了QTL置信区间，提高了QTL的定位精度。Dzievit等[44]通过单个群体或跨群体的联合连锁分析，检测到495个株型相关QTL，能解释表型变异的0.4%～85.1%。进一步通过Meta-QTL分析了325个非重叠QTL，找到58个真实性叶夹角QTL，分布在玉米的10条染色体上，其中叶夹角相关的热点区域主要分布在1、2、3、7和10染色体上。

表1 玉米叶夹角QTL定位汇总Table 1 QTL summary of leaf angle in maize

上述研究表明，玉米RILs群体、NAM群体、大刍草群体及SSR标记、SNP标记、GBS技术等均广泛用于叶夹角的QTL定位研究。国内外学者对现有QTL进行整合分析，明确了研究目标的重点区域与选择范围，相关结果为叶夹角基因的挖掘和克隆提供了重要信息。然而不同研究选用的材料不同，定位到的QTL存在显著差异，说明叶夹角QTL受遗传背景的影响较大，未来仍需利用不同材料定位新的叶夹角QTL。此外，现有叶夹角QTL定位的研究材料均为温带玉米种质，温带材料间遗传差异较小，其所构建的群体分离模糊，所报道的玉米叶夹角QTL效应普遍较小，不够稳定。此外，遗传群体与育种群体的不一致更加限制了遗传分析结果的育种价值。

4.2 玉米叶夹角相关基因的克隆

目前已克隆的玉米叶夹角相关基因有12个(表2)。Schneeberger等[51]最早利用转座子诱变法克隆了KNOX家族基因rsl，该基因编码RS1蛋白,与KN1结构域高度同源，rsl基因在顶端分生组织中周期性表达，并且主要在顶端分生组织叶片形成的叶环区以及花序和花分生组织形成的区域表达，时空表达分析显示rsl基因影响基部-末端轴向的形成过程。与野生型相比，rsl基因在突变体植株的叶原基中异位表达，影响叶舌和叶鞘的形成进而决定叶夹角的大小。随后，用相同的转座因子标签法克隆了lg1、lg2、lg3和lgn基因。Ku等[54]用豫82×沈137的F2:3家系，图位克隆了叶夹角基因ZmTAC1，其位于2号染色体qLA2区域，与水稻OsTAC1基因高度同源，编码263个氨基酸组成的功能未知蛋白。RT-PCR分析发现,ZmTAC1在叶鞘中的表达量最高，叶片和茎尖中较低。进一步研究发现，在紧凑型自交系豫82中，5’-UTR端序列为“CTCC”，在平展型沈137中，5’-UTR端为“CCCC”，该序列差异引起ZmTAC1基因在不同品种之间的不同表达，从而影响叶夹角的大小。此后，用相同的方法图位克隆了ZmCLA4、nanaplant2、ZmILI1、UPA2/UPA1、ZmIBH1-1等叶夹角基因。

玉米叶夹角基因的克隆为解析玉米叶夹角的遗传基础提供了新思路和新方法，最近基于CRISPR/Cas9系统，利用RNA介导的基因组定向编辑技术，对玉米自交系的lg1基因进行编辑并成功筛选到突变体[56]，为利用lg1基因改变叶夹角的大小开辟了新途径。但叶夹角性状由多基因调控，调控方式比较复杂，单基因在表型控制方面贡献效率较低，目前成功用于玉米新品种选育的叶夹角基因仅见于lg1和lg2。因此，在玉米叶夹角的发育调控研究中，亟待开展关键基因之间的网络调控研究，为玉米株型分子育种提供理论依据与技术支撑。

5 展望

我国玉米消费量的增长不可逆转，提高单产的压力越来越大，充分发掘玉米遗传资源的潜在优势，在育种技术升级的基础上，培育高产高效的玉米新品种，提高单位面积的产量是保障我国粮食安全的战略措施。近年来，株型育种已成为玉米遗传育种研究的重点领域，玉米叶夹角对高密度种植及产量具有决定作用，因此对调控叶夹角发育的机理及遗传研究已成为我国玉米研究的热点。

国内外关于玉米株型形态及分子调控机理的大量研究认为,植株中层的叶片大而宽，能截获更多的光能，光合作用强，叶绿素含量比上层和下层的含量高，尤其是在灌浆期，对玉米籽粒的形成过程影响较大。然而中部叶片能否得到充足的光照条件，取决于上层叶的叶夹角大小，随着太阳一天中的运动变化，如果穗上叶紧凑，有利于延长上层叶的受光时长，提高光合速率，并且减少了对中层及下层叶片的遮挡，有效促进了中层叶片叶绿素的积累，进而提高了玉米产量。因此,玉米叶夹角的形态建成及调控对玉米冠层结构及光合效率有重要决定作用，成为国内外研究的重点领域。目前已解克隆了一系列叶夹角调控基因，如lg1和lg2基因已成功应用于育种实践。然而由于玉米光合指标多为次级性状，与产量性状的相关性较低且重复性较差，加之玉米植株高大，增加了对玉米生理性状准确鉴定的难度，因此叶夹角形成的生理调控有待进一步研究。叶夹角的大小主要与叶片中脉的机械支持强度有关，挖掘影响叶脉强度的相关基因及解析其遗传机制，为改良叶夹角进一步提供有用信息。然而现有研究主要集中于叶原基、叶舌和叶耳的发育及油菜素内酯的代谢等，对叶脉强度及紧凑型与平展型植株间的生理性状差异比较等研究相对较少，亟待进一步加强。

目前国内外对玉米叶夹角的遗传规律及QTL定位方面开展了较多研究并取得显著进展，但仍存在以下问题：①不同研究选用的材料不同，定位到的QTL存在显著差异，说明叶夹角QTL受遗传背景的影响较大，未来仍需利用不同材料定位新的叶夹角QTL；②现有叶夹角的QTL定位研究材料均为温带玉米种质，温带材料间遗传差异较小，所报道的玉米叶夹角QTL效应普遍较小，在今后的遗传研究中，迫切需要从遗传变异丰富的热带玉米中挖掘玉米叶夹角QTL，拓宽玉米种质基础；③由于叶夹角QTL定位的亲本群体无法覆盖全部玉米种质，早期分子标记多为SSR标记，密度较低，检测到叶夹角相关QTL有限，并且定位到的大多QTL置信区间遗传距离较大，进一步精细定位后未能鉴定出目标基因并开发功能标记，因此难以应用到分子标记辅助选择等育种实践。

高通量、高密度分子标记检测技术的进步，以及生物信息学和统计学的发展，为深入研究玉米叶夹角的遗传机理展现了广阔的前景。未来玉米叶夹角的遗传研究有待进一步加强：①目前已完成全基因组测序的玉米种质包括73、Mo17、W22、SK、PH207、mexicana、HZS[25]，建议今后结合现有的QTL定位结果，利用生物信息学比较叶夹角QTL热点区域的序列差异，挖掘叶夹角相关候选基因并进行功能验证；②在已有QTL初定位结果的基础上，精细定位叶夹角相关候选基因，并解析其功能；③根据已克隆的叶夹角相关基因的序列，开发功能标记，结合分子标记的前景和背景选择，进行育种应用；④根据水稻、高粱及二穗短柄草中控制叶夹角发育关键基因的序列，在玉米B73、Mo17和SK的基因组中寻找相同物理位置或功能相似的基因，利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，筛选突变体，挖掘叶夹角发育关键基因。在上述研究的基础上还应深入研究基因间的互作，解析其信号转导通路，阐明叶夹角形成的分子机理，对玉米株型育种及高密度栽培等均具有重要的实际应用价值。