烟草青枯病发病程度的影响因素分析

樊 俊，谭 军，王 瑞*，施河丽，夏鹏亮，赵秀云

1.湖北省烟草公司恩施州公司技术中心，湖北省恩施市市府路65号 445000 2.华中农业大学生命科学技术学院，武汉市洪山区狮子街1号 430070

烟草青枯病是由劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种易感染、传播快、危害大的土传细菌性病害，是烟叶生产中的常见病害之一［1］。青枯病侵染烟株会造成植物快速枯死，给烟叶生产带来较大的经济损失，已成为限制烟草产业可持续发展的主要瓶颈之一［2］。

良好的土壤生态环境是农业生产可持续发展的重要基础［3］。土壤的养分平衡是促进烟株生长发育、增强植株抗病能力的关键措施之一［4-5］。李集勤等［6］通过相关性分析表明，土壤pH与青枯病发病率、病情指数均呈极显著负相关。有研究认为，土壤板结、酸碱度不平衡、理化性状恶化、矿质营养不足等可能是烟草青枯病发生的重要原因［7-8］。另外，土传病害的发生与土壤微生物的群落结构和特异性微生物的数量关系密切［9-10］。李小龙等［11］试验表明，劳尔氏菌在侵染植物过程中，能够引起植株感病部位微生物群落结构和多样性变化。烟株土壤微生物群落结构越丰富，多样性越高，抵抗病原菌的综合能力越强［12-13］。烟草青枯病的发生与土壤性状［14］、微生物结构［15］等有密切关系，通过调节植烟土壤微生态环境来抑制青枯病的发生已成为研究的热点之一［16-17］。然而，土壤是一个整体生态系统，目前不同青枯病发病程度的土壤理化性状、微生物群落差异的综合研究却鲜见报道。为此，采用分组分析、典范对应分析、相关性分析、主成分分析和最小数据集的方法，研究不同青枯病发病程度的土壤因子，旨在明确影响青枯病发病的关键因素，为烟草青枯病的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

土壤取样区位于湖北省恩施州宣恩县椒园镇和晓关乡，两个乡镇均是湖北省恩施州烤烟主产乡（镇），烟叶种植集中度较高，连作时间长。为减少其他生态因素引起的土壤性状差异，本试验中的取样点均分布在同一山系，方圆5 km范围内，海拔在900～1 100 m。选样区域内土壤类型为大泥土，烟草品种为云烟87，在烟苗移栽50 d左右开始发病；在移栽80 d后，调查青枯病病情指数，并选择不同青枯病病情指数的烟田进行土样采集。

1.2 病情调查

按照行业标准YC/T 39—1996［18］的方法，以株为单位详细调查烟株发病情况，并计算病情指数。

1.3 样品采集与制备

每块烟田先确定青枯病病情指数，再按照“之”形选取10～15株发病程度相同的烟株，拔出烟株根系，采用抖动法进行根际土壤样品采集，去除杂物并充分混匀后，分为两份分别装入保鲜袋和透气棉质袋。保鲜袋中的土样放入低温冷藏箱（-20℃）中保存，以提取土壤微生物DNA，进行16 S rRNA测序。棉质袋中的土样在室温下保存，自然风干后用于测定土壤化学指标。同时选择烟株周围10～15 cm垄体较完整的区域采集环刀样，将其包好后放入环刀盒，进行土壤物理指标的测定。

1.4 土壤理化指标测定

用pH计（PB-10，德国赛多利斯公司）［m（土）∶m（水）=1.0∶2.5］测定土壤pH［19］；重铬酸钾容量法测定有机质［19］；扩散法测定碱解氮［19］；硫酸-钼锑抗比色法测定速效磷［19］；火焰光度法测定速效钾［19］；乙酸铵浸提-原子吸收分光光度法测定交换性钙、钠、镁和阳离子交换量［19］；原子吸收法测定有效铁、锰、铜和锌［20］；沸水浸提-姜黄素比色法测定有效硼［20］。采用环刀烘干法测定土壤容重、含水率、总孔隙度、毛管持水量和通气孔隙度［21］。

1.5 土壤细菌群落高通量测序

利用Fast DNA®Spin Kit（美国麦普生物医药公司）试剂盒提取土壤微生物总DNA，采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNA的V3～V4可变区进行PCR扩增；PCR扩增体系总体积为25μL，包括土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5μL、Forward引物（1μmol/L）和Reverse引物（1μmol/L）各5μL、KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5μL。反应程序为：95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，25个循环；72℃延伸5 min。扩增后用2%（质量分数）的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物品质，再经纯化、质检后建立测序文库，采用Illumina Miseq PE250平台由北京诺禾致源科技股份有限公司测序［15］。使用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP Classifier对每条序列进行物种分类注释，选用Silva数据库，得到OTU的分类学信息［22］。

1.6 数据处理

利用Excel 2007和SPSS 22.0软件进行数据处理和制图，采用LSD法进行显著性检验，显著性为P＜0.05。最小数据集确定方法：选取不同青枯病发病程度有显著（P＜0.05）差异的土壤指标进行主成分分析。选择特征值大于1.0的主成分为研究对象［23］。对每一个主成分而言，变量载荷因子越大对该主成分贡献越大，定义因子载荷绝对值在最大因子载荷10%范围内的变量为高权重变量。高权重变量间进行皮尔逊相关性分析，相关系数r＜0.7时，各高权重变量都很重要均被选入最小数据集；r＞0.7时，选择相关系数和最大的高权重变量为最小数据集指标［24］。

2 结果与分析

2.1 烟田青枯病发病程度分析

对不同编号的烟田进行青枯病发病程度调查（图1），病情指数为0到1的有8块，为不发病土壤（编号为1～8）；病情指数在1到15之间的有6块，平均病情指数为4.39，为中等发病土壤（编号为9～14）；病情指数在15以上的有10块，平均病情指数为83.09，为高发病土壤（编号为15～24）。

图1 烟田青枯病病情指数分布Fig.1 Disease index of bacterial wilt in tobacco fields

2.2 土壤理化性状分析

由表1可以看出，土壤pH、交换性钙（ECa）、有效锰（AMn）、有效锌（AZn）、有效硼（AB）、碱解氮（AN）、速效磷（AP）在不发病与高发病土壤间存在显著差异。土壤速效钾（AK）、交换性镁（EMg）、交换性钠（ENa）、有效铜（ACu）、有效铁（AFe）、有机质（SOM）、阳离子交换量（CEC）在不发病与高发病土壤间差异不显著。青枯病病情指数 与 土 壤pH、ECa、AMn、AZn和 通 气 孔 隙 度（SAP）呈显著负相关（表2），相关系数（r）分别为-0.555、-0.499、-0.463、-0.447、-0.443，与土壤含水率（SWC）和土壤毛管持水量（SCC）呈显著正相关，r为0.427和0.495，表明土壤pH、ECa、AMn、AZn和SAP的增加与SWC和SCC的降低可能会抑制烟草青枯病的发生。

表1 青枯病不同发病程度的土壤基本理化性状分析①②Tab.1 Physicochemical properties of soils with different disease severities of bacterial wilt

表2 病情指数与土壤基本理化性状相关性分析①Tab.2 Correlation analysis between disease index of bacterial wilt and soil physicochemical properties

2.3 土壤细菌门水平分析

从图2可以看出，不同青枯病发病程度的土壤细菌中所占比例较高的门有变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）等。比较不同发病程度细菌门类的差异，变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Candidatus_Saccharibacteria、Cyanobacteria、Armatimonadetes在发病土壤中的相对丰度高于不发病土壤；酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）等在不发病土壤中的相对丰度高于高发病土壤。随着青枯病病情指数的增加，变形菌门、绿弯菌门、Candidatus_Saccharibacteria的相对丰度分别从24.40%、9.60%、0.54%增加到27.00%、12.50%、0.63%，而厚壁菌门和Latescibacteria的相对丰度从5.00%和0.75%降低到3.30%和0.62%。说明青枯病的发生对土壤细菌的主要门类影响较小，对部分细菌门类如变形菌门、绿弯菌门和厚壁菌门有较大的影响。

图2 不同青枯病发病程度土壤细菌群落在门水平上的组成Fig.2 Compositions of bacterial communities at phylum level in soils with different disease severities of bacterial wilt

2.4 土壤细菌属水平分析

不同青枯病发病程度的植烟土壤中OTUs数量在前100的细菌属超过了全部数量的90%，多数细菌种类数量并不占优势。不发病、中等发病与高发病土壤细菌属中存在显著性差异，且对烟田青枯病有影响的共10个属，其中在不发病土壤中占优势的有8个，包括鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、土壤红杆菌属（Solirubrobacter）、气微菌属（Aeromicrobium）、土微菌属（Pedomicrobium）、根瘤菌属（Rhizobium）、贪噬菌属（Variovorax）、诺卡氏菌属（Nocardia），另外的沙单胞菌属（Arenimonas）、劳尔氏菌属（Ralstonia）在高发病土壤中占据优势（表3）。与青枯病病情指数的相关性分析表明，鞘氨醇单胞菌属、土壤红杆菌属、根瘤菌属的OTUs数量与病情指数存在显著负相关（-0.565、-0533和-0.443），推测土壤中这3个属细菌数量的增加有利于抑制烟草青枯病的发生（表4）。

表3 不同青枯病发病程度土壤中显著性差异的细菌属OTUs数量Tab.3 Amount of OTUs of significantly different bacterial genera in soils with different disease severities of bacterial wilt

表4 病情指数与差异性细菌属OTUs数量的相关性Tab.4 Correlation analysis between disease index and amount of OTUs of bacterial genera with significantly different OTU amounts

2.5 典型对应分析（CCA）

选取在不同发病程度土壤中存在显著差异的SWC、SCC、SAP、pH、ECa、AMn、AZn、AB、AN和AP共10个指标作为环境因子，与细菌属水平OTUs数量进行CCA分析。结果（图3）表明，CCA1和CCA2可以解释变量的63.2%的信息。不发病土壤主要分布在纵坐标轴的右侧，高发病土壤主要分布在纵坐标轴的左侧，而中等发病土壤则在两侧均有分布。由图中箭头分布可以看出，SWC和SCC分布在纵坐标轴左侧，与高发病土壤细菌存在正相关；土壤pH、AMn、SAP、ECa、AZn、AN、AB、AP分布在纵坐标轴右侧，与不发病土壤细菌存在正相关。AMn对不发病土壤细菌影响明显，而SCC和SWC对发病土壤细菌影响显著。上述分析表明土壤pH、AMn、SAP、ECa、AZn、AN、AB、AP等的增加，可能有利于有益微生物群落的构建，进而抑制青枯病的发生，而SCC和SWC则有相反的作用。

图3 微生物与环境因子之间的典型对应分析（CCA）Fig.3 Canonical correspondence analysis（CCA）between microorganisms and environmental factors

2.6 主成分分析（PCA）

对青枯病病情指数有显著差异的10项土壤理化指标和青枯劳尔氏菌（Ralstonia）OTUs数量共11项指标进行偏相关度KMO检验，其KMO值为0.490（P＜0.001），说明指标之间存在相关性，适合进行主成分分析。

主成分分析结果见表5和表6，特征值大于1的主成分（PC）有4个，方差累积贡献率占原变量总方差的76.891%，基本保留了原11个变量的特征、差异和相互关系，说明这4个主成分基本反映了青枯病发病程度的主要影响因素。第1主成分贡献率为30.629%，其中SCC和SWC主成分载荷相对较高，分别为-0.948和-0.908，说明第1主成分是上述2个指标的综合反映；第2主成分贡献率为19.916%，其中pH、ECa和劳尔氏菌属OTUs数量主成分载荷相对较高，分别为0.718、0.624和0.638。第3主成分贡献率为13.630%，其中鞘氨醇单胞菌属OTUs数量主成分载荷相对较高，为0.673。第4主成分贡献率为12.716%，其中根瘤菌属OTUs数量和AMn主成分载荷相对较高，分别为0.587和0.558。由此，可将影响青枯病病情指数的变量分为{SCC、SWC}、{pH、ECa、劳尔氏菌属OTUs数量}、{鞘氨醇单胞菌属OTUs数量}、{根瘤菌属OTUs数量、AMn}共4大类。

表5 主成分分析Tab.5 Principal component analysis

表6 主成分因子载荷分析Tab.6 Factor loading analysis of principal components

2.7 最小数据集建立

由表6可知，在PC1中，高因子载荷有SCC和SWC，由于SCC因子载荷最大，且SCC与SWC的相关系数为0.952，达到极显著水平，因此PC1中SCC选入最小数据集。在PC2中，高因子载荷为pH，而ECa和劳尔氏菌属OTUs数量的因子载荷未能达到pH因子载荷的90%，因此PC2中仅pH入选最小数据集。在PC3中，高因子载荷有鞘氨醇单胞菌属OTUs数量1个指标，因此鞘氨醇单胞菌属OTUs数量入选最小数据集。在PC4中高因子载荷有根瘤菌属OTUs数量和AMn，因为两者相关性较小（r=0.140），均入选最小数据集。因此，影响烟草青枯病病情指数的最小数据集包括SCC、pH、鞘氨醇单胞菌属OTUs数量、根瘤菌属OTUs数量和AMn共5个指标，与青枯病病情指数相 关 系 数 分 别 为0.495、-0.555、-0.565、-0.443和-0.463，表明SCC、pH、鞘氨醇单胞菌属OTUs数量、根瘤菌属OTUs数量、AMn是烟草青枯病发生的关键土壤因子。

3 讨论

青枯病的发生不仅受到烟草品种抗性、气候条件等因素的影响，还与土壤理化性质和生物学特性等有重要关系［25］。土壤物理结构、养分供应水平和酸碱状况直接或间接影响植物的抗性和土壤病原物的侵染［26］。有学者认为土壤pH、质地、通气状况、温度和湿度等对植烟土壤青枯菌菌量和病害发生有很大影响［27-28］。本研究中发现，SCC与青枯病发病程度呈显著正相关，可能取样区域为鄂西南烟区，在烟叶生长季节雨水丰富，土壤含水量高，造成垄体通气不良，影响了根系生长发育［29］，降低了烟株对根茎部病害的抵抗能力；同时，土壤湿度大也易于青枯病的发生［30］。本研究中不发病土壤pH明显高于发病土壤，说明提高土壤pH有利于对烟草青枯病的控制，与谭军等［27］、郑世燕等［31］、黎妍妍等［32］的研究结果一致，其原因可能是酸化会加速土壤中含铝的原生矿物和次生矿物的风化而释放大量铝离子［33］，烟株长期和过量吸收铝的过程中，会导致根系遭到破坏、病菌易于入侵；同时，pH降低可促进土壤青枯劳尔氏菌丰度的增加［34］，致使烟田青枯病发病程度加重。烟草青枯病的发生与土壤矿质营养元素含量间存在密切联系，如锰、钙、钼等［11，35］。有研究表明，土壤中锰是烟草生长发育必需的微量元素，对维持叶绿体结构有重要作用，能够调节植物体内的氧化还原反应，增强植物的呼吸强度［35］。本试验中，土壤有效锰与烟草青枯病病情指数呈显著负相关，说明锰素营养可通过增强烟株对青枯病的抵抗能力，降低烟草青枯病的发生，与前人的研究结论相似［36］。因此，在大田烟叶生产中，需要注意改善土壤通透性，提高根系发育水平，调控土壤酸碱平衡，补充中微量营养元素（尤其是锰、钙和锌等），才能有效防控烟草青枯病的发生。

根据植烟土壤细菌16S rRNA测序结果可以看出，不同青枯病发病程度土壤之间的细菌门类组成基本相似，变形菌门、放线菌门和酸杆菌门等是植烟土壤中的优势菌门，这与前人的研究结果一致［12，37］。同时，青枯病发病土壤有增加变形菌门、绿弯菌门和降低厚壁菌门细菌相对丰度的趋势，可能烟株青枯病的发生与土壤中具有生物防治功能的芽胞杆菌类（属厚壁菌门，如枯草芽胞杆菌等）细菌相对丰度降低、病原菌类（属变形菌门，如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等）细菌相对丰度增加有关。

土壤中劳尔氏菌属OTUs数量是烟草青枯病发病的重要因子，本研究结果表明，其与病情指数的相关系数仅为0.158，没有达到显著水平，说明烟草青枯病的发生除了受到土壤中劳尔氏菌属OTUs数量的影响外，可能还与烟株自身的抗性、土壤微生物群落结构以及土壤水分状况、养分供应水平等因素有关［12，27，38］。通过主成分分析表明，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和根瘤菌属（Rhizobium）OTUs数量对烟草青枯病病情指数有重要影响。鞘氨醇单胞菌属在土壤中分布广泛，相对丰度较高［39］，具有高代谢能力与多功能的生理特性，可用于芳香化合物（如苯基脲类除草剂、六氯化苯等）的生物降解，对维护土壤生态平衡具有重要作用［40］。根瘤菌属为固氮微生物，在氮素缺乏的土壤中具有较强的竞争优势，土壤氮素含量的变化会影响固氮微生物与其他微生物的竞争关系，从而影响其群落组成［41］。说明土壤中鞘氨醇单胞菌属和根瘤菌属等不直接影响青枯病菌的中性微生物数量增加，但可能改善了土壤生态环境和养分供应状况，促进烟株的生长发育，增强了烟株对土传病害的抗性，进而抑制了烟田青枯病的发生。具体与青枯病的关系还有待进一步的研究。

4 结论

烟草青枯病病情指数与土壤pH、ECa、AMn、AZn、SAP和鞘氨醇单胞菌属、土壤红杆菌属、根瘤菌属等菌属微生物OTUs数量呈显著负相关，与SWC、SCC呈显著正相关。主成分和最小数据集分析表明，SCC、pH、AMn和鞘氨醇单胞菌属、根瘤菌属等的OTUs数量是影响烟草青枯病发生的关键土壤因子。