生物技术在烟草发酵领域的专利布局现状及热点分析

王金棒，邱纪青，汪志波，郑 路，洪群业，刘亚丽，郑新章

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

烟叶发酵是烟草加工过程的一项重要工序，发酵效果的好坏直接影响到烟叶的内在品质及其可用性。烟叶发酵的实质是在设定的温度和相对湿度条件下，促使烟叶的理化特性发生改变。在这一过程中，微生物、酶等生物制剂起到了关键性作用，通过物理、生理生化和化学反应促使一系列大分子物质的降解和香气物质的形成，进而在一定程度上消除底物存在的缺陷，如香气粗糙、刺激性大、土杂气重等。一般烟草工业企业内烟叶陈化多采用自然发酵法，但耗时通常较长，周期约1~2年，占用大量的仓库和资金。鉴于烟叶陈化过程中生物制剂的独特功能（专一性和高活性），通过人工施加生物制剂，并控制发酵周期来加速烟叶的醇化得到烟草行业广泛的关注和应用。专利制度是指国际上通行的通过法律手段确认发明人对其发明享有专有权，以保护和促进技术传播为目的的一种制度，以便实现更广泛的技术信息交流和技术的及时有偿转化。相比于其他类文献来源，专利文献所提供的信息更能够全面反映某一技术领域的发展现状和前沿动态。专利情报分析能够避免因信息缺乏而导致的“再发明”和“再研发”等重复性研究工作。据世界知识产权组织估算，合理有效地利用专利信息平均可以缩短60%的技术研发周期和节约40%的研发经费［1］。

鉴于此，为深入分析和准确研判生物技术（微生物和酶）在烟叶发酵领域的发展态势，以国家知识产权局公开/公告的应用于烟草的生物技术发酵类专利为分析对象，采用定量分析和对比分析法着重从专利申请人、技术主题以及具体技术分支等角度进行了文献计量学分析，旨在为广大科研人员的科研选题、提高科研效率等提供重要参考。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

本研究的对象为1985—2019年间国家知识产权局公开/公告的318件基于生物技术（微生物或酶）的烟草人工发酵或醇化类专利。除1件为实用新型专利外，其余均为发明专利。

1.2 数据获取方法

本研究中的专利原始数据来自国家知识产权局专利检索及分析平台（http：//www.pss-system.gov.cn）。数据检索策略主要是利用关键词“‘发酵或微生物或酶或菌’和‘烟草或烟叶或卷烟’”在专利标题、摘要、权利要求书及说明书全文中进行检索，并对检索得到的专利数据进行人工清洗和标引。

1.3 分析方法

采用Microsoft Excel 2010、Origin 9、ITGinsight对专利数据进行统计分析和作图，以实现对专利申请态势、专利申请人和技术主题分布的分析。

节点中心性是社会网络分析方法中常用的指标，包括点度中心度（Degree centrality，CD）、接近中心度和中介中心度3种。其中，点度中心度是利用网络中与某一节点直接相连的其他节点的个数计算节点在网络中地位的指标，可反映某一节点在网络中的中心位置或重要性［2-3］。本研究中借助ITGinsight软件计算点度中心度用于专利技术布局热点的筛选，其计算公式为：

式中：d（ni）为节点的度，即节点ni所拥有的联系数量；m是网络内节点的总数，m-1为网络内节点可能存在的最大联系数。

2 结果与分析

2.1 专利申请态势

2.1.1 专利申请年度分布

从专利申请的年度变化趋势（图1）分析可知，生物技术在烟叶发酵领域的专利申请可分为3个阶段：①1985—2000年期间，专利的数量较少，年度申请量为0~1件，处于起步阶段，国内烟草行业最早进行该领域专利申请的是常德卷烟厂，早在1996年就申请了“利用微生物发酵提高烟草品质的方法”［4］的专利，主要内容为从烟草中提取、分离出芽孢杆菌科微生物，经培养后施加到烟草上，能够明显缩短发酵周期，烟叶发酵5~12 d或烟丝/梗丝/再造烟叶丝发酵2~36 h，其颜色即可提高半个等级以上，香气量和香气质纯正，卷烟持火力增强，使用价值可提高一个档次以上；②2002—2009年，相关专利申请逐渐增多，申请量年度分布较为平稳，年平均为6件；③从2010年开始，专利申请进入快速发展期，2011年后年度平均申请量维持在25件左右，且整体呈增加态势。

图1 1985—2019年间生物技术在烟叶发酵领域的专利年度申请情况Fig.1 Annual distribution of patent applications related to tobacco bio-fermentation from 1985 to 2019

2.1.2 专利申请人分析

按申请人类别对检索到的专利按国内（国内烟草企业、国内其他企业、国内烟草科研机构、国内其他科研院所、国内大学、国内个人）和国外（国外烟草企业、国外其他企业、国外个人）类别进行标引并统计分析，结果见图2。可知，国内烟草企业在该领域的专利申请量具有绝对优势，占专利总量的58.9%，其次是国内大学和国内其他单位。

图2 申请人类型分布情况Fig.2 Distribution of the applicants for tobacco fermentation patents

为识别该领域的重要申请人，统计了各申请人的专利申请量，并列出了专利数量在5件以上的20位申请人的分布情况（图3）。其中，排名前4位的均是国内烟草行业工业企业，以云南中烟工业有限责任公司（云南中烟）的专利数量最多，其次是河南中烟、湖北中烟和川渝中烟，合计占前20位申请人总量的51.0%。说明在本技术领域，专利申请主体的集中度相对较高。

图3 专利申请数量5件以上具体专利权人的分布情况Fig.3 Distribution of the specific applicants with more than 5 patents

图4为国内烟草企业独立申请和合作申请专利分布情况图。可知，国内烟草企业共合作申请37件，占该属性专利申请总量的17.8%；其中，在各合作申请主体的单位中，国内大学的参与度最高，有27件相关合作申请，占合作申请总量的73.0%。另外，与国内烟草企业的合作方式具有明显的地域性特点，即中烟公司各法人单位主要与其所在地或附近省份的大学进行合作，申请量排名靠前的大学主要有郑州轻工业大学、江南大学和西北农林科技大学。申请人为国内大学的专利共有52件，其中，合作申请专利27项，均是与国内烟草企业合作完成。申请人为国内其他单位的专利共有43件，合作专利（4件）的合作方均为烟草行业外其他企业或个人。

图4 国内烟草企业独立申请和合作申请专利的分布情况Fig.4 Distribution of independent applications and cooperative applications of patents by domestic tobacco companies

2.2 IPC技术主题分析

专利技术的主题分布在一定程度上能够反映出一定时期内该领域中各创新主体所关注的技术研发热点。IPC（International Patent Classification，国际专利分类）分类是目前国内外通用的专利文献分类和检索的工具。为了进一步分析各专利申请人在该领域的技术研发态势，对检索到的国内外专利按照IPC分类代码小类（即国际专利分类号中的前4位）对其涉及的主题进行统计分析，共有27个小类，其中出现频次2次以上的IPC小类分布情况见图5。按照2018年版国际专利分类表，各主要IPC小类代码所代表的内容见表1。从图5可知，生物技术烟叶发酵领域的技术研发主要集中在A24B小类，归属于烟草大类，其次是C12N和C12R两个小类，归属于微生物或酶、组合物及其培养等技术类别，三者合计占专利频次总量的93.3%，技术的集中度较高，且三者具有较强的关联性，在专利文本中的共现频率较高。在其他小类的分布极少，尤其是在机械设备等领域，说明30余年来，在烟叶生物技术发酵方面，研发重点在于微生物或酶等生物制剂的开发，且大多数生物处理技术均适用于卷烟工业现有的工艺设备。

图5 1985—2019年烟叶生物技术发酵领域专利IPC频次在2次以上的小类分布情况（a）以及各IPC小类在同一专利中的共现关系（b）Fig.5 Distribution of IPC subclasses with more than 2 patents related to tobacco bio-fermentation（a）and the co-occurrence relationship of each IPC subclasses in the same patent（b）from 1985 to 2019

表1 烟叶生物发酵领域主要IPC小类所对应内容Tab.1 Contents of the main IPC subclasses in the field of tobacco bio-fermentation

对于C12N小类，技术分布主要有C12N1/00（139次）、C12N9/00（88次）和C12N15/00（10次）3个大组。其中，C12N1/00大组的专利主要是C12N1/20（97次，细菌及其培养基），其次是C12N1/14（18次，真菌）和C12N1/02（11次，从其培养基中分离微生物）；C12N9/00大组的专利分布较为分散，出现频次较多的主要是C12N9/42小组（16次，作用在β-1,4-糖苷键上，如纤维素酶）；C12N15/00大组的专利相对较少，且主要分布在C12N15/70（5次，专门适用于大肠杆菌的载体或表达系统）和C12N15/56（3次，作用于糖类化合物的酶，如淀粉酶、半乳糖苷酶、溶菌酶）2个小组。

对于C12R小类，技术全部分布在C12R1/00大组（微生物），主要分布在C12R1/07（35次，芽孢杆菌属）、C12R1/125（21次，枯草芽孢杆菌）和C12R1/01（16次，细菌或放线菌目）3个小组。

2.3 专利技术整体分析

根据所采用生物试剂的种类（微生物、生物酶、植物酶、仿制酶）以及所使用对象的不同（烟叶、烟梗、再造烟叶和烟秆表皮）对检索到的318件专利进行标引，统计分析结果见图6。可见，在生物试剂种类方面，在单一专利技术中，往往以微生物类或生物酶类为主，其次是微生物+生物酶混合制剂，来源于植物的内源酶或化学仿制酶技术的相关专利相对较少。在使用对象方面，绝大多数（73.0%）专利涉及烟叶的人工发酵，其次是烟梗（15.7%）和再造烟叶（10.7%）。

图6 烟草生物发酵领域专利所涉及生物制剂种类（a）及使用对象的分布情况（b）Fig.6 Distribution of types of biological reagents（a）and its objects in the field of tobacco bio-fermentation（b）

从生物发酵的功能效果分析，主要有13种。数据统计（图7）显示，生物发酵所达到的技术效果主要集中在减少杂气、降低刺激性等以及提高卷烟的香气量方面，其次是缩短烟叶的醇化周期。另外，通过生物技术降低烟碱、亚硝胺以及其他有害成分或有害成分前体物方面也有一定的专利申请。从各技术效果的共现关系分析，加速醇化和降刺增香2个功能的共现相关性最强，也是当前生物技术发酵领域专利布局的重点。

图7 烟草生物发酵领域专利所涉及技术效果的分布情况（a）和技术效果共现情况（b）Fig.7 Distribution of technical effects involved in patents related to tobacco bio-fermentation（a）and its co-occurrence of technical effects（b）

依据国际专利分类法中C12R相关分类标准以及国际通行的“检测细菌学Berger手册”对检索得到的人工发酵领域专利所涉及的微生物按照“属”进行标引，并统计分析。结果（图8）表明，专利所涉及微生物属共40个，其中涉及专利数量3件及以上的有13个。在微生物中，芽孢杆菌属的使用频次最多，其次是酵母菌、乳酸菌、曲霉和假单胞菌，其余微生物属的使用频次相对较低，均在10次以下。

图8 烟草生物发酵领域专利所涉及微生物种类的分布情况Fig.8 Distribution of microorganisms involved in patents in the field of tobacco bio-fermentation

对于芽孢杆菌属，除17件专利未明确说明所述菌株外（例如仅提供好气性芽孢杆菌、烤烟快速增香芽孢杆菌菌株等信息），对其余所述菌株的使用次数进行统计，结果见图9。可见，使用频次最多的芽孢杆菌主要有3种，分别是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。

图9 芽孢杆菌属所涉及微生物种类的分布情况Fig.9 Distribution of microorganisms involved in Bacillus

提取专利文本所涉及的生物酶（共47种）并统计分析，其中出现频次为5次及以上的生物酶主要有14种（图10）。可见，在各种生物酶中，出现频次最多的主要是纤维素酶、果胶酶和蛋白酶，其次是淀粉酶。从各种生物酶在同一件专利中的共现情况（图11）分析，排名靠前的这4种酶的相关性最大。此外，随着社会网络分析方法逐渐成为信息计量学研究的前沿和热点，节点的重要性或在网络中的位置可使用中心度进行度量［2-3］。同理，从生物酶各节点共现的点度中心度分析，除了重要程度最高的前4种主体酶（点度中心度为0.5~0.7）外，半纤维素酶、糖化酶、漆酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、烟碱脱氢酶、脂肪酶和木质素酶的重要程度也相对较高，点度中心度介于0.2~0.4之间，也是未来专利布局的重点。

图10 烟草生物发酵领域专利所涉及生物酶种类的分布情况Fig.10 Distribution of biological enzymes involved in patents of tobacco bio-fermentation

图11 烟草生物发酵领域专利生物酶的共现情况Fig.11 Co-occurrence of biological enzymes involved in patents of tobacco bio-fermentation

2.4 加速烟叶发酵专利分析

相比于自然醇化，借助生物酶技术的人工发酵旨在保障醇化效果（如增香、降刺、减害等）的基础上大幅度缩短烟叶醇化所需时间。目前，在卷烟工业中，烟叶或烟丝的醇化方式主要是离线处理。为进一步满足在卷烟生产线上直接醇化的需求，寻求高活性生物酶及其配套设备等依然成为卷烟企业在该领域的重要关注点。根据专利技术所采用生物制剂种类的不同，可划分为微生物制剂、生物酶或二者复合制剂3大类，按处理对象可大致分为烟叶、烟丝、烟梗、梗丝和再造烟叶等，其中以复烤后的烤烟烟叶为主。

为更好地反映生物制剂在加速烟叶发酵方面的显著效果，对相关专利按照所需最短发酵时间进行标引，并以“d”（天）为单位进行换算和统计，发酵时间在15 d以内的专利权人及其对应醇化周期的分布情况见图12。可见，施加微生物和酶均能大幅度缩短烟叶醇化周期，但各申请人的专利技术在加速的程度上差异显著，相比于微生物类制剂，直接使用生物酶类制剂在缩短醇化时间方面更具优势，最短仅需10~15 min即可实现烟叶的在线快速发酵［5］。另外，需指出的是，相比于烟叶，烟丝的发酵更为迅速，可能是烟叶成丝后与生物制剂的接触或混合更为充分所致，鉴于篇幅所限，本部分所述的技术分析主要以烟叶或片烟为主，少量涉及烟丝。

图12 烟叶生物技术发酵专利申请人及其对应最短醇化周期的分布情况Fig.12 Patent applicants for tobacco bio-fermentation and their technologies corresponding to the shortest aging periods

2.4.1 微生物菌剂

在烟叶基微生物菌剂方面，为使人工发酵后烟叶的品质更接近于自然醇化，由烟叶表面分离并筛选烟草发酵微生物是获得人工发酵菌株的一种十分重要的途径。基于专利视角，湖南中烟常德卷烟厂早在1996年就从烟草中分离、筛选出好气性芽孢杆菌属细菌，可分别将烟叶或烟丝的发酵时间缩短至5 d和2 h［4］。2019年，湖北中烟还从烟叶表面分离获得了一种高效增香型芽孢杆菌Bacillussp.J3，其具有淀粉酶活性、蛋白酶活性和多聚谷氨酸合成能力等功能，可将烟叶发酵周期缩短至3 d，发酵后烟叶的香气质和香气量也明显提升［6］。此外，陕西中烟分离筛选出快速增香菌芽孢杆菌LBT1.0003［7］和枯草芽孢杆菌［8］；广西中烟分离出芽孢杆菌Bacillussp.GYC30［9］；云南中烟分离出短小芽孢杆菌Bacillus pumilusVan35［10］；江西中烟分离出芽孢杆菌菌株BA-01［11］；华中农业大学分离得到一株高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）D2菌株等［12］，均能够实现烟叶的超快速发酵。

在其他单一菌剂方面，为进一步提高烟叶的整体感官品质，广西中烟和郑州烟草研究院合作采 用 深绿 木霉（Trichoderma atroviride）C9-13菌株［13］、河南中烟采用高效降解烟叶淀粉的苏云金芽孢杆菌XC-3菌株［14］、云南中烟采用洞穴芽球菌［15］以及四川中烟和湖北中烟分别采用一株异常威克汉姆酵母［16］和酿酒葡萄基天然酵母［17］等对烟叶进行快速醇化，有效降解了烟叶中的果胶、淀粉等高分子物质，使烟叶内在化学成分更加趋于协调。在其他功能领域，云南省烟草农业科学研究院采用荧光假单胞菌制剂处理烤烟烟叶，在24~48 h内可降解24%的烟碱［18］；黑龙江烟草工业有限责任公司采用微生物节杆菌Z3或制取的酶制剂发酵3 d即可实现白肋烟烟叶向烤烟香型的转化等［19］。

在复合微生物菌剂制备方面，通常在发酵过程中将两种或两种以上的微生物混合，然后施加到烟草表面进行快速发酵。在超快速发酵方面，微生物的筛选是关键。郑州轻工业大学基于特定的发酵工艺和设备，采用降烟碱菌株Z3节杆菌、增香菌株GXY35菌、云芝菌培养液体、提取的粗酶液制成的混合菌剂处理烟叶，可将发酵时间缩短至6 h［20］。华南理工大学基于自然发酵烟叶上的优势菌株及产香菌株，通过将枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌3种菌株混合制成复合微生物菌剂，使烟叶的醇化时间在1~730 d内可调［21］。

在晾晒烟或雪茄烟叶开发方面，江西中烟从江西特色烤烟烟叶“黑老虎”表面筛选出一种可提高晾晒烟醇化速度并提升其吸食品质的短小芽孢杆菌BP-01，BP-01具有产多种酶的能力，可将晾晒烟叶的发酵时间缩短至5 d［11］。中国科学院青岛生物能源与过程研究所和海口雪茄研究所针对雪茄烟叶合作开发的四段式发酵方法中，两段为微生物发酵技术，先在烟叶回潮阶段施加微生物复配菌剂（特基拉芽孢杆菌CSA-MEI-2-33、短小芽孢杆菌HD-7、蜡样芽孢杆菌M-5和巨大芽孢杆菌CAS5077-67-8-YNLC），发酵2~3 d用于降解烟叶中的大分子物质，而后再采用增香保润复配菌剂（出芽短梗霉UVMU6-1、微球菌-46和葡萄球菌CAS513-86-0-HNYZ）进一步发酵雪茄烟叶6~8 d，使烟叶风格凸显，雪茄香气饱满，刺激性明显降低，吸食品质更加协调［22］。河南中烟针对雪茄开发了一种微生物菌群制剂，含有酵母+（青霉、黑曲霉、毛霉、根霉中一种或几种任意比例混合）组合，可将雪茄烟叶的发酵时间缩短至10 d［23］。

2.4.2 生物酶制剂

在在线工艺方面，云南中烟开发了一种烟叶改性生物隧道在线处理工艺，可提供生物酶所需的适宜作用环境，对烟叶进行在线酶解5~15 min，即可达到烟叶的醇化效果［5］。湖北中烟开发了一种基于酶催化的烟草加工工艺，在加料工序后，采用酶制剂（中性蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶之中的单酶或2~5种酶的组合）对烟叶在贮叶柜醇化4 h即可提升烟叶质量［24］。内蒙古昆明卷烟有限责任公司将施加酶制剂（纤维素酶、脂肪酶、木素酶、果胶酶）放在烟草物料松散回潮阶段，通过改善酶制剂与烟草物料的接触程度提高发酵效率，可缩短发酵时间至20 h［25-26］。

在烟草内源微生物酶制剂方面，上海烟草集团和江南大学合作，采用黑曲霉制备混合酶（蛋白酶、淀粉酶等），可将上部烟叶的醇化时间缩短至1 h［27］。郑州烟草研究院采用哈茨木霉发酵制备纤维素酶粗液，对烟丝、片烟、烟梗酶解4~18 h即可明显降低烟草纤维素含量［28］。湖北工业大学采用短小芽孢杆菌菌株TX1，发酵后制得粗酶液，对烟叶中纤维素的降解也可缩短至3 h［29］。在其他微生物酶制剂方面，内蒙古昆明卷烟有限责任公司采用微生物（毛栓菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、康宁木霉）在烟叶培养基上分别制备出相应的高活性酶（中性蛋白酶、漆酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶），单独或与微生物结合用于烟叶发酵，可将发酵时间缩短至5 d［30-35］。

在复合酶制剂使用方面，中国科学院大连化学物理研究所将蔗糖酶、淀粉酶、麦芽糖酶、纤维二糖酶、果胶酶、复合纤维素酶和/或葡萄糖淀粉酶配制成复合制剂，发酵烟叶0.15~8.00 h，可使烟草中还原糖在可溶性总糖中的比例达90%以上［36］。河南中烟复配的酶制剂由α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶组成，对烟叶酶解6 h即可降解13.02%的蛋白质和16.89%的淀粉［37］。夏炳乐［38］采用复合酶（淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶）和活性调节剂（由钾盐、钠盐、钙盐和镁盐有机复合而成）制备了一种烟叶品质生物酶复合调节剂，对回潮后烟叶酶解18~24 h，可使烟叶内在质量提高1~2个等级。

复合酶制剂的固定化或缓释研究，旨在改善人工发酵烟叶抽吸品质弱于自然醇化烟叶的问题。云南瑞升科技有限公司研发了一种固定化生物酶制剂，即采用保护膜将细胞或酶限制在一定的空间范围内，通过避免与空气的直接接触和控制其释放速度达到延长使用时间的效果，所用壁材为海藻酸钠或β-环糊精，芯材为蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、多糖降解酶、纤维素酶，对低次烟叶烟丝酶解15~18 h，烟叶中总糖和还原糖的量分别增加7.9%和11.2%，香气质明显提高［39］。

在雪茄烟叶提质方面，专利权人主要有四川中烟和湖北中烟。四川中烟利用复合酶制剂（纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶、过氧化氢酶、漆酶、风味蛋白酶）对烟叶发酵8~24 h，可将大分子蛋白质降解为多肽或氨基酸，消除疏水性苦味肽，结合后续非酶棕色化反应等，能够从整体上改善雪茄烟叶的感官质量［40］。湖北中烟侧重于采用纤维素酶、果胶酶、风味蛋白酶、淀粉酶、氧化酶（多酚氧化酶、过氧化物酶）等单一或复配酶制剂经“浸柄+烟叶表面喷洒”工艺处理雪茄烟叶，发酵10~14 d，烟叶苦味明显改善，在香气特征、烟气特征、口感特征、燃烧性和灰色等方面的品质得到提高［41-43］。

2.4.3 微生物+生物酶混合制剂

在显著缩短人工发酵时间方面，混合使用微生物+生物酶制剂对烟叶进行发酵的专利相对不多。酶菌混合制剂主要有复配制剂以及微生物发酵粗酶液两种，其成分多以酵母或芽孢杆菌中的一种微生物辅以其他生物酶组成。河南中烟通过采用碱性蛋白酶和特定蛋白降解菌株（短小芽孢杆菌SMXP-03菌株）制备了一种复合生物制剂，可将雪茄烟叶的堆积发酵周期缩短至8 d［44］。上海烟草集团和江南大学合作，利用复合酶液（纤维素酶、淀粉酶、糖化酶）、烟草增质液（炒米汁或枣汁）和微生物种子菌悬液（热噬淀粉芽孢杆菌）制备出一种复合生物制剂，可将低次烟叶酶解和固态发酵周期缩短至5 d［45］。湖北中烟将复合生物制剂（扣囊复膜孢酵母和天冬酰胺酶）在白肋烟松散回潮后用于烟叶发酵1~3 d，后续再经天冬酰胺酶+美拉德反应工序，可明显降低烟气的刺激性，提高烟香和满足感［46］。

2.5 降低烟碱专利分析

相比于其他手段（浸提法和农艺措施），微生物技术的专一性相对较强，可以通过不同的代谢途径降解烟碱，也可以分解烟叶中的烟碱但不影响卷烟品质，有关微生物降解烟碱的研究国外早已有报道，相关菌类主要从烟叶或植烟土壤中分离得到［47］。国内相关专利申请最早是在2002年，王革［48］发现采用芽孢杆菌（短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌）在发酵烟叶的同时还具有降解烟碱的效果。在降低烟碱的相关中国专利中，企业或大学应用最多的生物制剂主要是节杆菌属、假单胞菌属以及烟碱降解酶等［20，49-57］，此外，在微杆菌、冠突散囊菌、链格孢菌、不动杆菌、乳酸菌、醋酸杆菌、摩氏摩根氏菌、中间苍白杆菌及红球菌等微生物菌属的烟碱降解方面也有专利申请［58-63］。

在节杆菌技术领域，广西中烟分离得到了烟草节杆菌——Arthrobacter nicotianaeGYC103，用其对烟叶发酵10~48 h，烟叶中的烟碱可降解2.9%~18.8%；同时其对蛋白质和淀粉还具有较强的降解能力［64］；云南省烟草科学研究院分别采用节杆菌（Arthrobactersp.）AS-1、节杆菌AS-2处理烟叶，烘烤结束后对烟碱的降解率可达36.9%~54.6%［51-52］。

在假单胞菌技术领域，红云红河烟草（集团）和中国农业科学院烟草研究所合作从植烟土壤中分离得到恶臭假单胞菌菌株，其对培养基中烟碱的降解效果显著［55］。云南省烟草科学研究院分别从烟叶和植烟土壤中分离得到荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌，用于烤烟烟叶的发酵，可分别降低28%和24%的烟碱［18］。此外，云南省烟草科学研究院还从植烟土壤中分离得到假单胞菌nic22，以其培养液制备粗酶液，可使烟草中烟碱的降解率达13.3%~33.1%［65］。

在酶制剂方面，通常是将具有烟碱降解功能的酶如烟碱脱氢酶、烟碱氧化酶等掺配到其他酶制剂中，同时达到缩短烟叶醇化时间以及降低烟碱的效果。云南万芳生物技术有限公司在烟叶复烤前采用烟碱脱氢酶制剂替代第二次烟叶润湿剂（水），可将烟叶中烟碱降低3.93%~8.08%［53］；此外，该公司还分别将烟碱氧化酶、烟碱降解酶与葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶等酶群复配，在润叶加料阶段施加复配制剂，处理后烟叶中烟碱可降低9.3%，烟气烟碱量可降低28.0%［66-67］。红云红河烟草（集团）将烟碱脱氢酶与蛋白酶、果胶酶、纤维素酶等进行复配，用于对片烟进行发酵，可降解烟碱6.1%~10.8%［68］。

2.6 降低主要有害成分专利分析

2.6.1 亚硝胺降解技术

烟草特有N-亚硝胺（TSNAs，Tobacco specialN-nitrosamines）主要产生于烟叶的调制过程，在这一过程中微生物起着重要作用［69］。因此，采用生物技术法调控该过程，可有效提高烟叶的安全性和综合品质。目前，用于烟草中TSNAs降解的生物制剂主要是菌类，如芽孢杆菌属和假单胞菌属等。国内专利以云南省烟草农业科学院为申请人的最多，其次是云南中烟和上海烟草集团。

在优势降解菌方面，云南省烟草农业科学院侧重于采用芽孢杆菌（短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌）或水生产碱菌处理烟叶，旨在降低调制或制丝过程烟叶或烟丝中4种主要的TSNAs（NNN、NNK、NAB和NAT），研究显示，分别采用高地芽孢杆菌J45、J54以及短小芽孢杆菌05-5402调制烟叶，4种主要TSNAs的总降解率分别为27.64%~52.37%、5.2%~46.6%和12.2%~17.3%［18，70-71］；采用水生产碱菌05-101处理烤烟和晾晒烟时，4种主要TSNAs的总降解率分别为6.1%~27.1%和14.5%~30.6%［72］；另外，采用05-101、J45、J54中的至少一种配制OD600值为1的菌剂也可同时用于烤烟和雪茄烟叶中亚硝胺的降解［73］。云南中烟侧重于烟草内生细菌的筛选和应用，研究显示，采用铜绿假单胞菌KenLXP30菌株或放射根瘤KenLXR34以叶面喷雾方式处理白肋烟烟叶，TSNAs的降解率分别为86.03%和54.46%［74］。上海烟草集团从晒红烟筛选出芽孢杆菌属菌株ECU1101，能够快速降解醇化烟叶中的TSNAs，对NNN、NNK、NAB和NAT的降解率普遍在8.5%~30.0%［75］。

除亚硝胺降解优势菌株外，云南中烟和上海烟草集团还发现在特定酶制剂作用下，TSNAs也能够得到降解，这为降解亚硝胺生物制剂的制备提供了一种新思路。上海烟草集团基于细胞色素P450酶，与NADPNa2、柠檬酸三钠和氯化镁组配后，在加表料工序施加到烟叶上，烟叶中NNK的降解率可达19.0%~24.8%，该制剂还可用于再造烟叶烟草浓缩液中亚硝胺的降解［76］。考虑到晒黄烟与烤烟的调制方式不同，云南中烟制备了一种用于烟叶TSNAs降解的复合酶制剂，由中性蛋白酶、果胶酶、木聚糖酶、糖化酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、中温淀粉酶、纤维素酶、中性脂肪酶和烟草复合酶中的5种或5种以上组成，通过降低烟叶中的总氮、硝酸盐、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱等前体物质，间接降低烟叶中TSNAs的量，降低率为26.4%~36.8%［77］。

2.6.2 其他有害成分降解技术

卷烟烟气中主要有害物质除烟叶成分的直接转移外，果胶、甾醇等大分子物质的裂解也是其主要来源。30余年来，我国烟草行业致力于卷烟的降焦减害，在农业、配方、辅材、工艺、选择性减害添加剂等关键技术方面取得了一系列突破和集成创新成果。其中，利用现代生物技术有针对性地降解烟叶有害成分及其前体物是卷烟降焦减害的重要原料加工途径，同时还能改善烟叶的综合品质。针对不同有害成分或前体物，所采用微生物或酶制剂的种类有所差异。从专利申请情况看，降解目标物主要有果胶、木质素、纤维素、蛋白质、甾醇、萜烯类化合物等，以此起到降低卷烟烟气焦油、CO、HCN、氨、酚类化合物、苯并［a］芘、巴豆醛以及丙烯酰胺等有害成分的作用。其中通过降解甾醇进而降低卷烟烟气中的稠环芳烃（含苯并［a］芘）是专利申请的重点。

在各种降低有害成分的专利申请中，川渝中烟、河南中烟、云南中烟以及雷诺烟草公司的专利相对较多。川渝中烟的专利技术侧重采用枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌冻干菌粉中一种或几种，或辅以后续膨胀技术降低烟气中的苯并［a］芘、巴豆醛、氨、焦油和CO等有害成分［78-80］。河南中烟和云南中烟主要致力于降低烟气中的苯丙［a］芘，河南中烟在再造烟叶制备过程中采用苏云金芽孢杆菌处理烟草提取物，主流烟气中的稠环芳烃可降低38.7%［81］；另外，还发现甲基杆菌在液相体系下对甾醇也具有相当的降解能力［81］。云南中烟侧重于采用甾醇降解菌TCD0001菌株降解烟草材料中的甾醇，针对不同的甾醇底物，降解率为2%~30%，以豆甾醇的降解效果最好［82］。雷诺烟草公司的中国专利技术与国内申请人不同，天冬酰胺的转化是其关注点，分别采用复合酶制剂或益生菌处理烟草，旨在降低烟气中丙烯酰胺，如采用天冬酰胺酶、氨基酸、二价和三价阳离子组合物、非还原性糖类物质、还原剂等复配制剂处理烟草，烟气中丙烯酰胺释放量可降低10%以上［83］；采用双歧杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、proionobacterium、芽孢杆菌属、酵母属、链球菌属及其混合物处理烟草材料，主流烟气中丙烯酰胺可降低20%~40%［84］；或采用上述酶和益生菌的混合制剂共同处理烟草材料，进而降低烟草制品主流烟气中丙烯酰胺的释放量［85］。

3 结论与展望

（1）在基于生物技术的烟叶人工发酵技术领域，常德卷烟厂早在1996年就申请了相关专利。自2010年，专利的申请量开始增加，年均申请量维持在25件，且有缓慢升高态势。

（2）在专利申请数量方面，国内烟草行业优势明显，以云南中烟的专利数量最多，其次是河南中烟和湖北中烟；在合作申请方式方面，以国内烟草行业单位与国内大学的合作申请为主，且具有明显的地域性特点，参与合作申请的烟草行业外单位主要有郑州轻工业大学、江南大学和西北农林科技大学。

（3）该领域IPC技术主题分布较为集中，主要涉及A24B、C12N和C12R 3个小类，且共现频繁，在其他小类，诸如机械设备等方面明显不足。C12N和C12R小类专利分别涉及细菌及其培养基和芽孢杆菌属微生物等技术。

（4）在具体技术领域方面，绝大多数专利涉及微生物或生物酶对烟叶的人工发酵，功能效果主要为降刺增香和加速烟叶醇化2个方面，其次是用于降低烟草中烟碱、亚硝胺或其他有害成分，其中降刺增香和加速醇化共现频率最高，是专利布局的重点。在微生物菌剂方面，以芽孢杆菌属的应用最多，主要有枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌3种。在生物酶制剂方面，应用较多的主要是纤维素酶、果胶酶、蛋白酶和淀粉酶4种，且共现频率最高，是专利布局的热点区域；在半纤维素酶、糖化酶、漆酶、木聚糖酶、葡萄糖氧化酶、烟碱脱氢酶、脂肪酶和木质素酶方面，也有适量的专利布局。

（5）相比于微生物和微生物+生物酶混合制剂处理技术，单独采用酶类制剂（含复合酶）处理烟叶，在缩短发酵时间方面效果更为显著。

为使微生物和酶以及相关制剂在卷烟生产企业制丝生产中得到应用，除了要具备合适的温湿度等环境条件外，处理时间也是非常重要的因素。许多在实验室中效果非常好的微生物和酶及其制剂，一旦应用到工业生产中，效果就会大打折扣，主要原因就在于正常的工业生产工艺并不能满足环境条件和处理时间等的要求。尽管采用生物技术发酵烟叶在增香降刺以及缩短发酵周期方面效果显著，但工业应用仍较少，对行业高质量发展的推动作用没有得到充分发挥，亟需加强该领域技术的集成、工程化及推广应用研究。另外，尽管微生物的来源主要是烟叶或植烟土壤，但在具体推广应用前，生物制剂（微生物或酶）的安全性评估仍值得关注，包括生产环境、卷烟消费和生态环境等3个方面。