高效液相色谱-蒸发光散射检测器法同时测定舞阳贝母中3种生物碱类成分的含量

李珊，王晓燕，张红伟*，李向阳，刘菊，黄霞（. 河南省食品药品检验所 国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，郑州 45008；. 郑州市中医院，郑州 450007）

贝母为百合科贝母属多种植物的鳞茎，是常用中药之一。我国贝母属植物资源丰富，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肃、湖北、安徽等省[1]。全国各地用作贝母的原植物种类繁多，各地均有代用品[2]。现代药理研究表明，贝母具有抑菌[3]、镇咳[4-7]、平喘[8-11]、抗肿瘤[12-16]等作用。舞阳贝母资源主要分布在河南省舞钢市、驻马店市、南阳市、信阳市等地，主要生长于海拔230～700 m的山坡草丛或疏林草地，舞钢为其分布中心，有较长的人工栽培和使用历史[17]。舞阳贝母作为河南省特有的药材资源，现已收入河南省中药材标准，中药材名为“贝母”，为百合科植物舞阳贝母Fritillaria wuyangensisZ.Y.Gao的干燥鳞茎或鳞叶。现有研究多针对主要活性成分阳贝母生物碱类进行含量测定[18-25]。生物碱类成分具有显著的镇咳、平喘、祛痰、抗炎活性[26-29]，本文首次采用HPLC-ELSD法同时测定舞阳贝母中3种生物碱类成分，并考察了不同产地加工方法对其含量的影响，以期为舞阳贝母的进一步开发利用、产地加工规范化以及质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪、ALLTECH2000 ES ELSD（安捷伦），XPE205万分之一电子天平（梅特勒托利多），Mili-Q Advantage A 10超纯水系统（美国Millipore公司），KQ-250E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。乙腈为色谱纯（德国默克股份两合公司），三氟乙酸、甲醇、三氯甲烷、氨水为分析纯，超纯水为自制。12批舞阳贝母样品信息见表1，经河南省食品药品检验所雷留成主任药师鉴定为百合科植物舞阳贝母Fritillaria wuyangensisZ.Y.Gao的干燥鳞茎或鳞叶。对照品贝母辛（批号：111892-201402，含量：100.0%）、贝母素甲（批号：110750-201913，含量：98.4%）、贝母素乙（批号：110751-201712，含量：97.7%）（中国食品药品检定研究院）。

表1 样品信息Tab 1 Sample information

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为YMC-Triart C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，21%A；10～35 min，21%～33%A；35～50 min，33%A）；柱温为30℃；流速为1.0 mL·min－1；进样量为10 μL；检测器为ELSD，漂移管温度为105℃，载气为氮气，流速为2.5 L·min－1，增益值为1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的对照品各适量，加甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为0.4092、0.4986、0.4208 mg·mL－1的混合对照品溶液，于冰箱内冷藏保存，备用。

2.2.2 供试品溶液 取本品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液4 mL浸润1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）的混合溶液40 mL，称定重量，混匀，置80℃水浴中加热回流2 h，放冷，再称定重量，加上述混合溶液补足减失的重量，滤过，用相应的溶剂洗涤锥形瓶和滤纸，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验

对照品及供试品按“2.1”项下色谱条件测定，3种生物碱类成分色谱峰之间分离度均＞1.5，理论塔板数均＞12 000，色谱图见图1。

图1 混合对照品（A）和舞阳贝母样品（B）的HPLC图Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A）and Fritillaria Wuyangensis sample（B）

2.4 线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品溶液1、2、3、4、5、6、10 mL，分别置于7个10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，制成系列不同质量浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录其色谱图，以峰面积对数值（lgA，Y）为纵坐标，以对照品质量浓度对数值（lgC，X，mg·mL－1）为横坐标进行线性回归，建立回归方程，结果见表2。

表2 3种生物碱类成分的线性方程和线性范围Tab 2 Linear equation and linearity of 3 alkaloids

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的峰面积，计算得到其RSD分别为1.8%、1.9%、1.6%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取6号样品粉末6份，每份约2 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定3个生物碱类成分含量，结果贝母辛、贝母素甲、贝母素乙RSD分别为0.77%、1.6%、1.7%，表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液（4号样品），分别于0、2、4、8、12、24、36 h进样测定，结果贝母辛、贝母素甲、贝母素乙峰面积RSD分别为0.66%、0.96%、1.3%，表明供试品溶液在36 h内稳定。

2.8 加样回收试验

精密称取已知含量的6号样品6份，每份约1 g，精密加入贝母辛对照品溶液（1.0641 mg·mL－1）、贝母素甲对照品溶液（1.7152 mg·mL－1）、次贝母素乙对照品溶液（1.0967 mg·mL－1）各1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定含量，并计算回收率及RSD，结果贝母辛、贝母素甲、次贝母素乙的平均加样回收率分别为97.6%、96.3%、98.8%，RSD均≤1.9%。

2.9 样品含量

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见表3。

表3 3种生物碱类成分含量测定结果(n＝3，%)Tab 3 Content determination of 3 alkaloids (n＝3，%)

3 讨论

3.1 提取条件的选择

本文比较了不同提取溶剂系统（氯仿、甲醇、氯仿-甲醇混合溶液）、不同提取方法（超声、回流）、不同提取时间（60、90、120、150 min）等因素对舞阳贝母中3个生物碱类成分提取效果的影响，结果提取效率氯仿-甲醇混合溶液＞甲醇＞氯仿，生物碱类化合物易溶于极性较弱的溶剂，如氯仿等，2020年版《中国药典》一部浙贝母含量测定项下采用了氯仿-甲醇（4∶1）作为提取溶剂，氯仿可以减少水溶性杂质的溶出，而甲醇穿透性强，故在氯仿中加入甲醇增强穿透性有利于生物碱类成分的溶出。回流法提取效率高于超声法，选用了回流法。提取时间以120 min最好，保证了3种生物碱类成分充分溶出。最终确定本文所采用的提取方法。

3.2 色谱条件的优化

贝母类药材中生物碱类成分众多，且大多是立体异构体，难以分离，本文比较了乙腈-水、乙腈-0.1%二乙胺、乙腈-0.1%三氟乙酸3个流动相系统，分别考察了等度及梯度洗脱，发现乙腈-0.1%三氟乙酸流动相系统梯度洗脱，对3个生物碱成分的分离度、灵敏度及柱效均优于其他流动相系统，且由于流动相系统中存在酸性试剂，在LC-MS中使用时会比碱性流动相系统更有利于生物碱类成分的离子化，检测灵敏度提高，有利于舞阳贝母药材中生物碱类成分的进一步研究，故选用乙腈-0.1%三氟乙酸流动相梯度洗脱。

比较了5种不同色谱柱Agela-Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）、YMC-Triart C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）、Waters-Symmetrm C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）、JADEPAKRS C18（4.6 mm×250 mm，5 µm），发现5种色谱柱均能将贝母中3种生物碱有效分离，最终发现色谱柱YMC-Triart C18（4.6 mm×250 mm，5µm）不仅对3种生物碱化合物分离度良好，且在不同的流速（0.5、0.8、1.0 mL·min－1）条件下均具有最优的色谱图基线，出峰数目及理论塔板数，故最终选择此色谱柱，确定流速为1.0 mL·min－1。

3.3 蒸发光散射检测器条件的选择

确定流动相的种类和梯度洗脱条件后，比较不同氮气流速、不同漂移管温度时3种生物碱类成分的信号强度和基线噪音，确定了蒸发光散射检测器的检测条件：漂移管温度为105℃、氮气流速为2.5 L·min－1。

3.4 含量测定结果分析

由含量测定结果可知，12批次舞阳贝母中贝母辛、贝母素乙含量普遍较低，分别为贝母辛（0.0183%～0.1040%）、贝母素乙（0.0348%～0.1061%），贝母素甲含量普遍较高（0.0933%～0.2048%）。此外，本文采用的12批舞阳贝母样品是由硫熏、传统炕制和烘箱烘干3种不同的产地加工方法加工而成，由测定结果中的3种生物碱类成分总量可知，烘箱烘干的样品含量最高（0.2929%～0.3695%），其次是传统炕制（0.2252%～0.2659%），硫熏含量最低（0.1504%～0.2058%），可见不同产地加工方法对3种生物碱类成分总量产生较大影响，烘箱烘干损失较小，而硫熏损失较大，有文献报道显示硫磺熏蒸不仅使中药材及饮片残留大量的二氧化硫，还伴随有复杂的化学反应，会导致多种有效成分的化学结构和含量发生改变[30]。

舞阳贝母作为河南特色药材，针对其化学成分的基础研究较少，探讨舞阳贝母的生物碱类成分，对考察舞阳贝母质量，保证临床用药稳定性和有效性具有一定的意义。本文首次建立同时测定舞阳贝母中3种生物碱类成分的采用HPLCELSD法，操作简便，准确度高，专属性强、可用于舞阳贝母中贝母辛、贝母素甲、贝母素乙3种成分的定量分析，为舞阳贝母的质量研究提供了重要的研究基础。