高效液相色谱联用质谱法对睡莲花中4种成分的鉴定和含量测定

李洁，丁文欢，樊珍珍，张浩科，田树革（. 新疆医科大学第一附属医院药学部，乌鲁木齐 8300；. 新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐 8300；3. 新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐 8300）

睡莲花是睡莲科植物雪白睡莲Nymphaea candidaC. Presl的干燥花蕾，具有降热止咳、止痛、益心安神等功效，临床用于治疗感冒发热、头痛咳嗽、心悸不安、咽痛或热证引起的头痛、热感咳嗽及小儿急、慢惊风等表症[1]。其主要分布在我国新疆，也是多种抗病毒复方制剂中的主要的组方药材[2]。药理学研究表明睡莲花具有抗氧化、抗菌、消炎、降血糖、保肝等作用[3]。睡莲花主要含有鞣质、黄酮类成分等成分，其中没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷、槲皮素等是发挥抗菌、保肝作用的主要成分[4-5]，因此，本实验采用HPLC-UV-MS/MS对上述4种成分进行定性定量分析，以期获得更准确可靠的方法，为睡莲花的质量控制提供基础研究。

1 材料

1.1 仪器

KQ-200KDE型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS-105型电子天平（瑞士梅勒-托利多公司）；TGL-16B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；AK-1000A型摇摆式中药粉碎机（温岭市奥利中药机械有限公司）；HY-BⅡ型回旋振荡器（金坛市医疗仪器厂）；6310 ion trap 液质联用系统（美国Agilent公司），包括Agilent 1200高效液相色谱仪，1100型紫外检测器。

1.2 试药

睡莲花样品于2012年8月—2013年2月分别从新奇康药业股份有限公司、维药制药厂和维吾尔医院等地收集，共6批，由新疆医科大学中医学院中药系徐海燕副教授鉴定为睡莲花Nymphaea candidaC. Presl。没食子酸对照品（纯度：98%，批号：110831-2012054，中国食品药品检定研究院），没食子酸甲酯对照品（纯度：99%，批号：92366A，瑞士阿达姆斯试剂有限公司），槲皮素对照品（纯度：98.5%，批号：20111013，上海源叶生物科技有限公司），烟花苷对照品（纯度：97%）由新疆药物研究所赵军博士提供，色谱甲醇（飞世尔实验器材有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 分别精密称取适量没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷、槲皮素对照品分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，制成质量浓度分别为0.450 mg·mL－1没食子酸、0.410 mg·mL－1没食子酸甲酯、0.531 mg·mL－1烟花苷、0.340 mg·mL－1槲皮素的混合对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液 睡莲花粉末过3号筛，精密称定1 g，置具塞锥形瓶中，加入50 mL的甲醇溶液，称定，超声提取30 min（功率80 W，频率100 Hz），放冷，再次称重，用甲醇补足减失的重量，用0.45 μm微孔滤膜过滤后取滤液，备用。

2.2 色谱及质谱条件

采用Agilent C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.2%冰 乙酸水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱：95%→90% A（0～10 min），90%→75% A（10～20 min），75%→55% A（20～40 min），55%→15% A（40～50 min），15%→0% A（50～60 min）。流速1 mL·min－1，进样量20 μL，柱温30℃，检测波长270 nm。

质谱参数：负离子扫描模式（ESI－），毛细管电压为3.5 kV，雾化气（氮气）压力是30 psi，干燥气温度为350℃、流速为12 L·min－1，雾化气、干燥气均为氮气。一级质谱、二级质谱扫描范围均为m/z100～650，锥孔电压范围0.4～1 V。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性 在“2.2”项色谱条件下，分别进样对照品溶液及供试品溶液各20 µL，结果各组分峰形良好，无干扰峰，各峰之间的分离度均符合要求，见图1。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of mixture standards（A）and samples （B）

2.3.2 线性范围考察 取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样。以对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归计算，结果见表1。

表1 睡莲花中4种化学成分的回归方程Tab 1 Linear regression equation of the 4 components in Nymphaea candida C. Presl

2.3.3 精密度试验 取“2.1.1”项下混合对照品溶液20 µL，按“2.2”项下色谱条件下连续进样6次，测定峰面积，结果没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷和槲皮素的峰面积的RSD值分别2.1%、1.8%、1.5%、2.0%。表明该仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 称取按“2.1”项下方法配制的供试品溶液6份，进样测定。含量RSD值分别为没食子酸1.3%、没食子酸甲酯1.5%、烟花苷1.1%和槲皮素1.8%，表明本方法的重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 按“2.1”项下方法制备供试品，分别在室温放置0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷和槲皮素峰面积的RSD值分别为2.0%、1.4%、1.8%、1.3%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.6 加样回收试验 精密称取已知含量的供试品6份，分别加入已知含量的80%、100%、120%混合对照品适量混匀，在“2.2”项色谱条件下测定，结果没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷和槲皮素的平均加样回收率分别为98.87%、100.34%、103.25%、101.56%，RSD分别为0.45%、0.68%、0.52%、1.4%。

2.4 睡莲花中4种成分的鉴定

将4种化合物对照品分别进行质谱分析，通过优化质谱条件，在全扫描一级、二级质谱中，4种化合物对照品溶液的分子离子峰和碎片离子峰显著，具体结果见表2及图2。在相同色谱条件下，将混合对照品与供试品溶液进样分析，如图2所示，混合对照品溶液的色谱图中，没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷和槲皮素保留时间分别为9.35、23.19、45.65和48.18 min，且供试品出现相同保留时间色谱峰，同时比较一级、二级质谱，且对应出相同分子离子峰和碎片离子峰，鉴定出睡莲花中该4种化学成分。

图2 睡莲花中4种化学成分的一级、二级质谱图Fig 2 MS and MS/MS spectrogram of 4 components in Nymphaea candida C. Presl

表2 睡莲花中4种化学成分的质谱信息Tab 2 Mass data of 4 components in Nymphaea candida C. Presl

睡莲花中没食子酸、没食子酸甲酯为简单的酚酸类化合物，质谱裂解行为较为简单，主要为取代基羧基和羟基的丢失，没食子酸的准分子离子由m/z168.7脱去羧基（－44），得到m/z124.7的碎片离子（见图3A）；没食子酸甲酯（m/z182.7）则是先脱水（－18）得到没食子酸的离子峰（m/z167.6），再脱去羧基（－44）得到m/z124.7的碎片离子（见图3B）；烟花苷属于黄酮苷类化合物，准分子离子峰m/z593.3，通过脱去两个葡萄糖，得到黄酮苷元（m/z284.7）（见图3C）；槲皮素属于黄酮醇类化合物，黄酮类化合物由于A，B苯环较稳定性不易开裂，因此质谱裂解主要发生C环的retro-Diels-Alder（RDA）裂解，以及包括丢失中性H2O，CO和CO2的过程。槲皮素的准分子离子峰300.8发生RAD裂解，得到m/z178.6的碎片，继续失去中性分子CO进一步裂解产生裂片离子m/z150.06，再丢失CO2产生m/z106.7的碎片（见图3D）。

图3 睡莲花中没食子酸（A）、没食子酸甲酯（B）、烟花苷（C）和槲皮素（D）的质谱裂解途径Fig 3 Mass fragmentation patterns of gallic acid，methyl gallate，nicotiflorin and quercetin in Nymphaea candida C. Presl

2.5 样品含量测定

按“2.1.2”项下方法制备各批次供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进行测定，4种成分含量见表3。6批不同批次的睡莲花中，没食子酸、没食子酸甲酯、烟花苷、槲皮素的含量分别在8.00～15.61、1.10～3.26、20.24～28.31、1.83～2.40 µg·g－1。其中烟花苷与没食子酸的含量较高，没食子酸甲酯与槲皮素次之。

表3 样品中4种化学成分的含量测定结果(µg·g－1，n＝3)Tab 3 Content of 4 components in Nymphaea candida C. Presl (µg·g－1，n＝3)

3 讨论

睡莲花具有清热解毒，镇静安神的功效[6]，是多种复方、单方制剂的组方药材，本研究建立了HPLC-UV-MS/MS法同时测定睡莲花中4种成分。本文分别用水、70%乙醇、无水乙醇、70%甲醇、甲醇结合超声提取法提取样品，发现甲醇的提取率较高，因此选用甲醇作为提取溶剂。采用甲醇-水、甲醇-0.2%冰乙酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%冰乙酸水溶液进行梯度洗脱，发现各成分在甲醇-0.2%冰乙酸水溶液中响应良好且有较好的色谱峰，故采用甲醇-0.2%冰乙酸水溶液作为流动相。

对被测成分的质谱参数进行优化，这4种成分在负离子模式下的响应远高于正离子模式，在负离子检测模式下易产生加合离子峰，故确定选择负离子模式下检测4种主要成分。将丰度最大的子离子作为定量离子，保证了方法的专属性和准确性。

在质量控制方面，HPLC-MS/MS[7-12]等现代分析技术得到了广泛应用，色谱的强分离性能与质谱的强定性相结合，尤其在缺乏对照品的情况下，对色谱峰鉴定分析，有助于药材的质量控制[13-15]。由于睡莲花存在基源不清、代用混用等问题，导致药材质量标准不完善，本实验采用HPLC-UV-MS/MS法测定样品中4种化学成分的含量，归属其主要的一级、二级质谱特征，提供有力的鉴定证据，该方法操作便捷、结果准确且重现性较好，可为其质量控制提供实验依据，也可为研究睡莲花及其制剂的体内外代谢分析提供参考，从而促进新疆特色资源睡莲花的开发利用。