基于三维荧光与BLLS/RBL同时检测蜂蜜中3种喹诺酮类抗生素

赵兴涛，车先阁，王书涛，刘诗瑜，苑媛媛

(燕山大学 电气工程学院 河北省测试计量技术及仪器重点实验室，河北 秦皇岛 066004)

1 引 言

我国每年蜂蜜的出口可占全球蜂蜜总出口量的20%[1]，蜂蜜质量问题越来越受到广泛关注。2019年8月的国家市场监管部门在发布食品不合格情况通告中，曾有多批次蜂产品检出喹诺酮类抗生素，因此,建立一种快速有效的蜂蜜中抗生素检测体系是尤为重要的。喹诺酮类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强、价格低廉等特点，被广泛应用于兽医学中[2]。在蜂蜜实际生产过程中,喹诺酮类药物可以防治蜂病如美洲幼虫腐臭病、麻痹病等，并且能够提高蜂蜜产能[3]。但是，喹诺酮类药物在动物体内代谢缓慢，容易产生蓄积和残留,人体长期服用抗生素残留过量的蜂蜜会造成潜在的危害，特别是机体对抗生素的耐药性[4]。

目前，针对蜂蜜中喹诺酮类抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等。夏环等[5]采用分子印迹固相萃取-高效液相色谱法对蜂蜜中3种喹诺酮类抗生素残留进行了检测，3种抗生素的加标回收率范围为96.5%～104.1%；徐宜宏等[6]采用超高效液相色谱串联质谱法对蜂蜜中多种抗生素进行了残留检测，实验结果得到的平均回收率范围为68.0%～104.0%，相对标准偏差为3.2%～15.5%。但是这些方法对操作人员的要求较高，样本预处理比较复杂，提取过程也不易操作[7]。而三维荧光光谱法具有灵敏度高、操作简单、不需要大量样本的特点，近年来被广泛应用到食品有害物质残留检测及环境污染检测中[8]。尹春玲等[9]采用三维荧光光谱结合交替不对称三线性分解法(AATLD)对牛奶中弗洛沙星、培氟沙星和伊诺沙星进行了检测研究，实验结果令人满意，定量解析出的弗洛沙星、培氟沙星和伊诺沙星的平均回收率分别为97.87±4.91%，97.55±5.45%，102.13±5.75%；Osorio等[10]采用荧光光谱结合多元校正的方法对养殖水体中的氟喹诺酮类药物进行了残留测定，实验基于二阶和三阶校准共建立了两种校正模型，经过实验结果对比后证明，三阶校正模型U-PLS-RTL拥有更好地拟合度和性能指标，得到的样品回收率范围在93%～112%之间。但是目前采用三维荧光光谱法对蜂蜜中喹诺酮类抗生素的检测研究的类似报导很少。

本文采用三维荧光光谱法对蜂蜜可能存在的3种喹诺酮类抗生素残留，氟甲喹(FLU)、恩诺沙星(ENR)和左氧氟沙星(LVFX)的混合组分溶液进行荧光测量，将二级瑞利散射区置零和空白溶剂扣除法消除了光谱中的二级瑞利散射和拉曼散射干扰，采用小波优化集合经验模态分解(ensemble empirical mode decomposition, EEMD)的方法对光谱进行去噪，完成光谱预处理过程。结合双线性最小二乘/残差双线性(BLLS/RBL)方法，对预处理前后的光谱数据进行定性、定量检测，该检测手段有效地解决了混合组分中出现的光谱重叠问题，实现了利用“数学分离”代替“化学分离”。预处理前后的定量结果对比表明：样本经过预处理后，其定性、定量结果更为准确。

2 实 验

2.1 主要试剂与仪器

实验试剂：荆花蜂蜜，京东汪氏蜂蜜官方旗舰店购买；喹诺酮类抗生素标准品，FLU标准品(纯度98%)、ENR标准品(纯度98%)，LVFX标准品(纯度98%)均购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；十二烷基硫酸钠SDS(化学纯)购买于国药试剂网；超纯水，由优普纯水仪(成都优普仪器设备有限公司)制备。

实验仪器：FA1004精密电子秤(郑州宝晶电子科技有限公司)；FS920稳态荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)；HY-5A回旋振荡器(国华电器有限公司)。

2.2 实验样本制备

实验溶剂制备：精确称量10 g SDS标准品，适量超纯水溶解至烧杯中，水浴加热10 min，待冷却至室温后，用超纯水定容至100 mL棕色容量瓶中，得到浓度为100 g·L-1的SDS储备液，4 ℃避光保存。移液枪量取5.5 mL SDS储备液，用超纯水定容至100 mL容量瓶中，得到浓度为5.5 g·L-1的SDS实验溶液。

蜂蜜溶液制备：精确称量2.733 39 g蜂蜜溶于100 mL,、浓度为5.5 g·L-1的SDS溶剂中，得到蜂蜜浓度为27.333 9 g·L-1的蜂蜜实验溶液。

抗生素单组分对照样本制备：精确称量FLU、ENR、LVFX标准品各0.01 g，用SDS实验溶液定容至100 mL容量瓶中，回旋振荡20 min后，得到浓度为0.1 g·L-1的3种物质的储备液，于4 ℃避光保存。移液枪量取0.4 mL FLU储备液、0.04 mL的ENR和0.02 mL的LVFX储备液，用SDS工作溶液定容至100 mL容量瓶中，得到40 μg·L-1的FLU实验溶液、4 μg·L-1的ENR实验溶液和2 μg·L-1的LVFX实验溶液。

蜂蜜抗生素残留溶液制备：分别取适量抗生素的标准溶液依次添加进蜂蜜溶液中，共配制了16组不同浓度的抗生素残留溶液样本，各样本蜂蜜的浓度均为27.333 9 g·L-1，其中C1-C10设定为校正集，T1-T6设定为预测集，如表1所示。

表1 校正样本及预测样本浓度Tab.1 Concentration of calibration and prediction samples μg/L

3 实验结果与分析

3.1 光谱预处理

3.1.1 去散射处理研究

将FS920光谱仪进行参数设置： 激发波长范围设置为250～450 nm，步长为 5 nm; 发 射 波 长 范 围设置为290～550 nm，步长为2 nm; 并设置发射波长滞后激发波长10 nm，以消除一级瑞利散射干扰[11]。入射狭缝和出射狭缝设置为2 mm，样品室温度设置为恒定20 ℃。

设置完毕后，对实验配制样本进行三维荧光光谱扫描，得到16组131×41的数据矩阵。其中测得纯蜂蜜样本C3的三维荧光投影图和等高线图如图1所示。

从图1中可以看出，光谱图存在二级瑞利散射(1)和拉曼散射(2)的干扰。二级瑞利散射的特点是散射波长约为激发波长的2倍，而拉曼散射的散射波长比激发波长略大，随着激发波长的变化而相应变化，且与激发波长保持恒定的频率差。这两种散射均无法通过仪器参数设置来消除，且散射的荧光强度远远大于被测物质的荧光强度，使得被测物质的光谱被掩盖，无法对物质进行精确分析。

图1 蜂蜜原始光谱图Fig.1 Original spectrum of honey

为此，采用将二级瑞利散射区置零和空白溶剂扣除的方法来消除光谱中的二级瑞利散射和拉曼散射，蜂蜜去散射后的荧光光谱图如图2所示。

从图2中可以看出，去除光谱中的二级瑞利散射后，蜂蜜的光谱得以部分显现出来，但是由于拉曼散射的存在，不能反映出光谱的全部信息。当去除拉曼散射后，蜂蜜的光谱得以完整地显现出来，可以看出蜂蜜存在两个荧光峰，分别位于最佳激发/发射波长为285/326 nm和345/436 nm处。但是光谱图存在很明显的噪声干扰，不利于后续的定性、定量研究。

图2 蜂蜜去散射后的荧光光谱图Fig.2 The fluorescence spectrum of honey after de scattering

3.1.2 小波优化EEMD算法原理与评价指标

EEMD工作原理的实质是，通过EEMD分解被测光谱数据， 得到若干个本征模态分量(intrinsic mode function, IMF)，按频率从高到低排列，通过将噪声集中的IMF分量舍去，剩余分量叠加重构，完成对光谱的去噪过程[12]。

但是该方法同样存在缺陷，即保留的IMF分量中，也有少量噪声存在，相应地，舍弃的IMF分量也有非噪声信号存在，舍弃过多分量会造成过度去噪，相反，则会造成去噪不完全。

为此提出采用小波阈值法对选取的IMF分量进行二次去噪，再进行重构的思想完成光谱去噪过程。具体过程如下:

(1) EEMD分解：运用EEMD方法分解给定的含噪光谱数据，得到若干个IMF分量。

(2) 选取IMF分量：求取原始光谱与其IMF分量的相关系数，相关系数较大的IMF保留不作处理，相关系数小的IMF分量，利用小波阈值法进行二次去噪处理。

(3) 重构光谱：将保留的IMF分量与经过小波处理后的IMF分量叠加，得到去噪后的光谱。

3.1.3 去噪结果评价指标

引入信噪比(SNR)、波形相似系数(NCC)、均方根误差(RMSE)来衡量不同去噪算法的结果[13]。SNR是指信号与噪声的比例，信噪比越高，代表去噪效果越良好。NCC是计算降噪前后信号的波形的差异，其值越接近于1，说明过度去噪的程度越小。RMSE表示降噪前后数据差值的平方均值。计算公式分别为

(1)

(2)

(3)

3.1.4 去噪结果分析

采用小波优化EEMD算法对光谱进行去噪处理，去噪后的蜂蜜等高线图如图3所示。将去噪结果分别与小波和EEMD的方法进行比较，不同方法去噪结果的评价指标如表2所示。

图3 小波优化EEMD去噪后的蜂蜜等高线图Fig.3 Contour map of honey after denoising by wavelet optimization EEMD

从图3和表2可以看出，小波优化EEMD算法对光谱的去噪效果良好，在保持原有光谱特征的基础上更加平滑、清晰，有利于后续的定性、定量研究。而且该方法的去噪结果评价指标均优于小波和EEMD算法。将其余样本数据均进行去散射、去噪处理。

表2 不同方法去噪结果评价指标Tab.2 Evaluation indexes of different noise removal methods

图4分别给出经光谱预处理后的3种抗生素对照样本和T5样本的等高线图，可以看出，LVFX有两个荧光峰，分别位于最佳激发/发射波长为300/484 nm和330/484 nm处；ENR有两个荧光峰，分别位于最佳激发/发射波长为280/440 nm和330/440 nm处；FLU有一个荧光峰，分别位于最佳激发/发射波长为325/364 nm处。3种抗生素物质荧光峰位置相似，其混合组分存在着严重的光谱重叠现象，而且抗生素混合组分的荧光强度强于蜂蜜，掩盖了蜂蜜的荧光光谱，只凭观测光谱图难以定性区分溶液各物质组分。

图4 C1、C2、C3和T1样本预处理后的等高线图Fig.4 Contour map after pretreatment of C1, C2, C3 and T1 samples

3.2 蜂蜜抗生素残留混合溶液的定性定量分析

3.2.1 BLLS/RBL算法

BLLS/RBL是二阶校正算法之一，可以实现复杂混合物分析的二阶优势[14]。

该算法分为校正和预测两个步骤，将被测物质的光谱数据分为校正集和预测集两个部分，具体实现步骤如下[15]：首先将校正数据矩阵X(大小为J×K)矢量化，将Ic个校正样本集分组为JK×Ic的矩阵，记作Vx：

Vx=[vec(X1)|vec(X2)|…|vec(XIc)]

(4)

式中vec为展开操作。

采用直接最小二乘，获取单位浓度Vs下的单组分物质矩阵信息，该过程用公式表示为

Vs=VXY+

(5)

式中：Y+表示大小为I×Nc的校正浓度矩阵，Nc为校正分析物的数量。

Vs大小为JK×Nc，包含了矢量化的Sn矩阵：

Vs=[vec(S1)|vec(S2)|…|vec(SNc)]

(6)

如果每种分析物只含有一种光谱组分，Sn的秩将为1。因此可以通过每个大小为J×K的Sn矩阵的单组分奇异值分解(SVD1)来获取组分轮廓图,

(bn,gn,cn)=SVD1(Sn)

(7)

式中：bn是第一个奇异值；gn(J×1)和cn(K×1)分别为第一个左和右特征向量。

gn和cn分别是第n个分析物在J和K方向上的归一化纯轮廓。每个vec(Sn)根据bn，gn，cn重建，完成校准步骤。

Srn=bn[gn⊗cn]

(8)

式中⊗表示克罗內克乘积。

校准后，如果未知样品不包含干扰物质，则可直接采用最小二乘法来估计测试样品中的浓度。

(9)

式中：Xu为测试样品数据；yu包含校准分析物Nc的估计浓度；Scal可以表示为

Scal=[b1(g1⊗c1)…bNc(gNc⊗cNc)]

(10)

3.2.2 定量结果评价指标

回收率(RH)表示样本浓度真实值与预测值的接近程度，计算公式分别为

(11)

灵敏度(SL)表示单位浓度的净分析信号,计算公式为

(12)

式中：hn是比例系数;||||F是矩阵的Frobenius范数。

检出下限(Lout)表示在一定置信度下，可检测的最低分析物浓度，计算公式为

Lout=3.3Sd(0)

(13)

式中：Sd(0)为低浓度样本预测浓度的标准偏差。

3.2.3 定性鉴别

采用核一致值诊断法(core consistency diagonosis, CORCONDIA)[16]分别对光谱预处理前后的样本进行组分数估计，一般认为当核一致值不低于60%时，结果最接近实际样本组分数。经计算，未经预处理的样本，当因子数设定小于6时，核一致值高于60%，但是样本实际组分数为4，其原因是样本存在的散射和噪声被认定为了一个组分。而经预处理后的样本，因子数设定为小于5时，核一致值高于60%，与实际组分数相同。由此可知采用预处理后的样本的组分数估计更准确，而未经预处理的样本不能正确估计组分数。

因此，采用BLLS/RBL算法分别对预处理前后的实验样本进行定性鉴别，并将各单组份抗生素实验样本数据同样输入进算法模型中，生成各组分抗生素的真实光谱曲线，与混合组分解析出的光谱形成对比，其定性结果分别如图5和图6所示。可以看出：数据经预处理后，解析的溶液中3种抗生素组分的激发光谱和发射光谱与各自的真实光谱匹配程度十分良好，蜂蜜组分由于在混合溶液中的荧光强度较低，其解析光谱与真实光谱会有略微差异，但是综合解析得到的蜂蜜的激发光谱和发射光谱，可以确定溶液中含有蜂蜜组分。

图5 未经预处理样本的解析光谱与原光谱Fig.5 Analytical and original spectra of untreated samples

图6 经预处理后样本的解析光谱与原光谱Fig.6 Analytical and original spectra of samples after pretreatment

为了更直观地显示出定性结果的准确性，表3给出了解析光谱与原光谱的相似度，可以看出经预处理后各组分解析光谱与原光谱的波形相似度较高。而未经预处理的定性结果，解析出的光谱包含散射和噪声干扰，与原光谱的吻合程度明显不如经预处理后的结果，且无法准确解析出蜂蜜组分。实验结果表明：经预处理后的样本采用三维荧光光谱结合BLLS/RBL算法可以完成蜂蜜中喹诺酮类混合物质的定性鉴别。

表3 BLLS/RBL解析光谱与原光谱的相似度Tab.3 similarity between BLLS/RBL analytical spectrum and original spectrum

3.2.4 定量检测

采用BLLS/RBL分别对预处理前后的样本进行定量检测，其结果如表4所示。可以看出BLLS/RBL方法定量经过预处理后的样本得到的FLU的RH在86.92%～101.38%之间，平均回收率RA达到94.99±0.63%，Lout为2.08 μg/L；ENR的RH在93.25%～104.20%之间，RA达到100.20%，Lout为0.18 μg/L；LVFX的RH在95.38%～118.00%之间，RA达到103.20%，Lout为0.19 μg/L，均优于未经预处理样本的定量结果。此外，经预处理后的样本的定量结果的均方根误差(RMSE)与灵敏度SL同样优于未经预处理的样本。由此表明：采用BLLS/RBL算法可以实现蜂蜜中喹诺酮类抗生素混合组分的定量分析，而且样本经过预处理后，其定量结果的精度得到了显著提高。

表4 浓度预测结果Tab.4 Concentration prediction results

4 结 论

针对蜂蜜中喹诺酮类抗生素的残留问题，提出了采用三维荧光光谱技术结合BLLS/RBL算法实现蜂蜜中抗生素混合组分残留的定性、定量检测，该方法具有操作简单，灵敏度高，无需复杂的样品前处理过程等特点。研究了光谱数据预处理对定性、定量结果的影响，样本经过预处理后，定性分析中样本组分数的确定更加精准，定量分析中，各项评价指标相比未经预处理的检测结果都有了提高。结果表明：对样本进行预处理可以有效提升定性、定量结果的精度。