肝素钠肌醇烟酸酯乳膏防治冻伤作用的药效学实验研究

崔亚玲，刘小虎，许子华，吴 琼

冻伤是由于低温或在寒冷环境中长时间暴露而发生的全身或局限性组织损伤，常发生在环境温度低于0 ℃时，多发生于肢端尤其是关节突出的部位[1-2]。冻伤患者缺血性组织损伤和坏死的发生率较高，随着冻伤皮肤温度的下降，内皮细胞损伤可导致四肢局部水肿；血液黏度增高会引起血液流速减慢，并形成微血栓。微血管损伤、静脉淤滞和微血栓都会促进冻伤引起的局部缺血[3]。冻伤病程较长，反复发作，无特效治疗方法。肌醇烟酸酯是一种温和的周围血管扩张剂，可选择性地使寒冷刺激的病变部位和敏感部位的血管扩张，而对正常血管的扩张作用则较弱。肝素钠属黏多糖类物质，能干扰凝血过程的许多环节，其机制主要通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合，而增强对活化的Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ和Ⅻ凝血因子的抑制作用，阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而抑制纤维蛋白原变成纤维蛋白。肝素钠常用于防治血栓形成或栓塞性疾病引起的弥漫性血管内凝血(DIC)，也用于血液透析、体外循环、导管术等操作中及血液标本抗凝处理。本研究分析了肝素钠和肌醇烟酸酯以不同比例配伍联合用药对提高机体冷刺激耐受力的效果，旨在探讨肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对大鼠轻度冻伤的防治作用。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1实验仪器：N4型紫外可见分光光度计(INESA)，PV-200型足趾容积测量仪(成都泰盟科技有限公司)。DT-100电光分析天平(北京光学仪器厂)。PBY-N6 Compact全自动血液流变仪(北京普利生食品有限公司)。CA1500全自动凝血分析仪、XN-1000全自动模块式血液分析仪均购于SYSMEX公司。FLPI2-MOOR和MOORVMS-OXY均购于MOOR生产公司。BC/BC-518A卧式冷藏冷冻转换柜(青岛海尔特种电冰柜有限公司)。

1.1.2实验药物：肝素钠肌醇烟酸酯乳膏(中国人民解放军北部战区总医院，批号：201508063)；肝素钠乳膏(山东博士化福瑞达制药有限公司，批号：150624031)；赋形剂——肝素钠肌醇烟酸酯乳膏基质(中国人民解放军北部战区总医院提供，批号：201508062)；乙酸(沈阳化学试剂有限公司)；二甲苯(天津市百世化工有限公司)；伊文思蓝(国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.3实验动物：SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001。SD大鼠，雌雄各半，体质量180～220 g，由辽宁长生生物技术有限公司提供，实验动物合格证号：SCXK(辽)2015-0001。

1.2方法

1.2.1饲养方法：各组雌雄小鼠、大鼠分笼饲养,常规颗粒饲料喂养，自由饮水，12 h自然光照，室温控制在0～25 ℃, 湿度为40%～60%。无菌垫料、饮水瓶定时更换，定时消毒。

1.2.2肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响：将昆明种小鼠60只，随机分为对照组、模型组和低、中、高剂量组(分别给予肝素钠肌醇烟酸酯乳膏0.39、0.78、1.56 g/kg)及肝素钠乳膏组(0.39 g/kg)，每组10只。对照组、模型组右耳部正反面涂抹赋形剂；高剂量组右耳正反面涂抹肝素钠肌醇烟酸酯乳膏，4/d；中剂量组右耳正反面涂抹肝素钠肌醇烟酸酯乳膏，2/d；低剂量组右耳正反面涂抹肝素钠肌醇烟酸酯乳膏，1/d；肝素钠乳膏组右耳正反面涂抹肝素钠乳膏，1/d。6组均涂药7 d。第7天涂药后1 h，用干棉签将残留药膏擦干净，除对照组外其余各组小鼠右耳郭滴加20 μl二甲苯，20 min后处死小鼠，剪下左右耳，用7 mm打孔器沿左右耳郭相同部位打孔取材，分别称重，以两耳重量差值作为肿胀程度[4]，并进行统计学分析。

1.2.3肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响：取体质量18～22 g小鼠60只，雌雄各半，随机分成对照组和低、中、高剂量组(分别给予肝素钠肌醇烟酸酯乳膏0.39、0.78、1.56 g/kg)及肝素钠乳膏组(0.39 g/kg)，每组10只。给药组小鼠按规定剂量外用给药，空白对照组给予赋形剂，剂量同低剂量组，连续给药7 d，末次给药后30 min，各组均于鼠尾静脉注射1%伊文思蓝生理盐水0.1 ml/10 g后，每只大鼠立即腹腔注射0.6%乙酸0.2 ml，30 min后断颈处死小鼠，用5 ml生理盐水冲洗腹腔渗出的伊文思蓝，吸取腹腔液，3000 r/min离心5 min，取上清液，用分光光度计在波长590 nm测定吸光度[5]。

1.2.4肝素钠肌醇烟酸酯乳膏预防给药对大鼠实验性冻伤模型的影响：取体质量为180～220 g健康SPF级大鼠60只，雌雄各半，随机分为对照组、模型组和低、中、高剂量组(分别给予肝素钠肌醇烟酸酯乳膏0.27、0.54、1.08 g/kg)及肝素钠乳膏组(0.27 g/kg)，每组10只。除对照组外，各组大鼠右后肢涂对应剂量的药物，模型组涂赋形剂，连续给药7 d；于第7天给药1 h后将除对照组外的各组大鼠放入-20 ℃冰柜中，1 h后取出，造成Ⅰ度冻伤模型(Ⅰ度冻伤：伤及表皮，皮肤局部红肿、充血，症状在暖和时缓慢消失，表皮脱落，水肿消退，不留瘢痕)，让其在室温下自然复温。各组大鼠分别于冻伤造模前和冻伤造模后测量右后足趾容积，观察造模前后大鼠足跖容积变化值，计算足跖肿胀值(造模后容积与造模前容积之差)[6-7]，于造模第7天测定大鼠右后足局部血流量和血氧，并进行统计学分析。

1.2.5肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对大鼠实验性冻伤模型的影响:大鼠分组、用药及造模方法同“1.2.4”；各组大鼠于造模后第2天右后肢涂对应剂量的药物，模型组涂赋形剂，连续给药7 d。分别于冻伤造模前和冻伤造模后1、3、5、7 d测量各组大鼠右后足趾容积变化值，计算足跖肿胀值(造模后容积与造模前容积之差)，于造模第7天测定大鼠右后足局部血流量和血氧，并进行统计学分析。

2 结果

2.1肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响 6组小鼠耳肿胀度为对照组(0.010±0.001)g、模型组(0.016±0.005)g、低剂量组(0.010±0.002)g、中剂量组(0.010±0.003)g、高剂量组(0.010±0.003)g、肝素钠乳膏组(0.010±0.011)g。与对照组比较，模型组二甲苯所致小鼠耳肿胀度明显提高(P<0.01)，说明造模成功。与模型组比较，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏低、中、高剂量组及肝素钠乳膏组小鼠耳肿胀减轻(P<0.05)。

2.2肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 对照组和低、中、高剂量组及肝素钠乳膏组小鼠腹腔液吸光度分别为1.01±0.35、0.67±0.29、0.63±0.29、0.63±0.17、0.63±0.17。与对照组比较，低、中、高剂量组和肝素钠乳膏组小鼠腹腔液吸光度均降低(P<0.05，P<0.01)。

2.3肝素钠肌醇烟酸酯乳膏预防给药对大鼠实验性冻伤模型的影响 模型组冻伤后足趾肿胀值高于对照组(P<0.01)，说明造模成功。与对照组比较，模型组血流量增高，血氧降低(P<0.01)。与模型组比较，造模7 d后，低、中、高剂量组和肝素钠乳膏组大鼠足跖肿胀值和血流量降低(P<0.01)，但血氧比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏预防给药对大鼠冻伤模型足跖肿胀值、血流量及血氧的影响

2.4肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对大鼠实验性冻伤模型的影响 与对照组比较，模型组冻伤造模后第5、7天肿胀值增高更显著(P<0.05，P<0.01)，说明造模成功。与模型组比较，低、中、高剂量组和肝素钠乳膏组造模后第5、7天大鼠足跖肿胀值降低(P<0.01)。与对照组比较，模型组冻伤后第7天血流量增高，血氧含量降低(P<0.05，P<0.01)。与模型组比较，连续给药7 d后，低、中、高剂量组及肝素钠乳膏组血流量降低，低、中剂量组血氧升高(P<0.01)。见表2。

表2 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对大鼠冻伤模型足跖肿胀、血流量及血氧的影响

3 讨论

冻伤是高寒地区或从事低温作业人员的常见急症，Ⅱ度冻伤伤及真皮，皮肤局部明显充血、水肿，12～24 h内形成水疱，2～3周内干燥结痂，以后脱痂愈合，可有轻度瘢痕形成。Ⅲ～Ⅳ度为重度冻伤，主要损伤全层皮肤、皮下组织、肌肉和骨骼[8-9]。

冻伤是机体的一部分组织因寒冷侵袭而出现的血液循环障碍，主要表现为冻结的表面组织融化后产生炎症反应[10-12]。有研究表明，冻伤可引起微血管收缩、毛细血管通透性提高、血液黏度增加、血流阻力增大等，使局部组织血流量明显减少，最终导致组织细胞因缺血缺氧而坏死[13-14]。本研究结果显示，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏具有明显改善二甲苯造成耳部急性渗出性炎性水肿和抑制醋酸引起腹腔毛细血管通透性增强的作用，说明肝素钠肌醇烟酸酯乳膏能够消除炎症反应，防止皮肤感染，并能有效透过冻伤的皮损，降低毛细血管通透性；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏预防及治疗给药能明显减轻轻度冻伤模型大鼠足跖肿胀度和充血，治疗7 d后大鼠冻伤后足跖肿胀及血流量基本恢复至正常水平。前期实验研究结果显示，大鼠冷冻恢复室温后，血流量明显降低，第3天开始皮肤温度和血流量持续升高，炎症反应加重，给药治疗3～7 d后，血流量和足肿胀基本恢复正常，能够很好地防治轻度冻伤。

综上所述，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对大鼠冻伤后的组织有明显的保护作用，具有良好的抗炎、预防和治疗轻度冻伤的作用。