多囊卵巢综合征患者肠道菌群结构变化与神经肽Y的相关性分析

王雪姣 刘 蕊 胥 婷 施 羽 李林霞 卫东琴 丁晓颖 彭永德

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育龄女性常见的生殖内分泌代谢紊乱性疾病，其在育龄期女性中的患病率为6%～20%[1-2]。PCOS是一种具有终生倾向、全身代谢紊乱的内分泌疾病，因其异质性强，至今尚无完全有效的控制方法[3]。

肠道菌群作为一个庞大的微生物群，定植于人体肠道内[4]，参与宿主的消化、营养、代谢、免疫等生理和病理过程，其失衡可能导致多种疾病的发生[5]。目前已有多项研究[6-8]显示，PCOS患者存在肠道菌群紊乱，并且肠道菌群参与调控PCOS的发病。肠道菌群结构和功能改变影响肠-脑轴相关激素的分泌[9-10]。本团队的前期研究[6,11]发现，与非肥胖健康女性相比，PCOS患者存在肠道菌群紊乱，促生长激素释放素(ghrelin)和肽YY(peptide YY，PYY)等肠-脑轴相关激素分泌减少，且与肠道菌群紊乱密切相关。以上研究提示，肠道菌群可能通过调节机体肠-脑轴导致PCOS患者内分泌代谢功能障碍。神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)可以调节机体食欲、能量储存等各种生理功能[12]。一项人群研究[13]结果显示，能量限制联合益生菌治疗可使肥胖女性机体NPY水平升高。目前,鲜有研究关注NPY与PCOS及其伴随的肠道菌群紊乱的关系。在前期研究的基础上，本研究通过校正BMI，拟探讨PCOS患者肠道菌群结构变化与NPY水平之间的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 对前期研究数据进行筛选，匹配两组患者年龄，最后选取2014年1月—2016年6月在上海交通大学附属第一人民医院内分泌科和妇产科就诊的PCOS患者21例纳入PCOS组，在社区招募健康育龄期女性13例纳入对照组。PCOS诊断标准采用2003年鹿特丹标准，满足以下3点中的2点即诊断为PCOS：①高雄激素的临床表现或实验室检查结果；②稀发排卵或不排卵；③卵巢多囊样表现。同时需排除先天性肾上腺皮质增生症、产生雄激素的肿瘤、库欣综合征等其他病因[14]。所有入选者均为BMI≥18 kg/m2的育龄期女性。排除标准：3个月内接受抗生素治疗者，妊娠期或哺乳期女性，合并其他可能引起高雄激素血症和排卵障碍的疾病，3个月内使用过糖皮质激素、性激素或降糖药物等，患有肝病或肾病等其他系统严重疾病，有酗酒等其他不良嗜好。本研究经医院医学伦理委员会审核、批准(审批号2014KY091)，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 样本采集 收集所有受试者的基础临床资料，禁食8～12 h后留取空腹血液样本，并进行口服葡萄糖耐量试验，留取服糖后2 h的血液样本。多毛评分采用Ferriman-Gallway毛发评分法。应用ELISA试剂盒(EZHNPY-25K,美国EMD Millipore公司)检测血清NPY水平。体格检查当天使用无菌容器留取中段粪便，迅速干冰冻存后-80 ℃保存，用于下一步检测分析。

1.3 粪便DNA提取和16S rRNA V3-V4区测序 粪便样本DNA提取采用Godon 等[15]的方法。使用Miseq试剂盒V3 (600-cycle) (MS-102-3033,美国Illumina公司)在Illumina Miseq平台(美国Illumina公司)对所有样本进行测序。16S rRNA V3-V4区测序方法参照Illumina的官方操作指南 (Part#15044223 Rev. B)进行，并根据参考文献[15]进行部分修改。

1.4 高通量数据处理 根据Zhang等[16]的描述，对获得的序列进行质量控制，利用Usearch软件(Usearch 8.0.1623_i86 linux32)划分操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)，相似度为100%的序列被划分为单一序列(unique sequence)，按丰度排序，去除丰度为1的单一序列，去除嵌合体，相似度≥97%的序列划分为1个OTU。

2 结 果

2.1 临床一般资料 PCOS组BMI、腰围、腰臀比、餐后2 h血糖(2hPG)、餐后2 h胰岛素(2hINS)、HbA1c、TG、黄体生成素(LH)、LH/卵泡刺激素(FSH)、睾酮水平和多毛评分均显著高于对照组(P值均<0.05)，NPY水平显著低于对照组(P<0.001)。两组间年龄、FSH、FBG、空腹胰岛素(FINS)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、TC的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 对照组与PCOS组的基础临床资料比较

2.2 NPY水平与临床资料的相关性分析 校正BMI后，偏相关分析结果显示，机体血清NPY水平与LH/FSH、睾酮、多毛评分均呈显著负相关(r=-0.420、-0.449、-0.398，P=0.017、0.009、0.022),NPY水平与FINS呈显著正相关(r=0.396,P=0.022)。见表2。

表2 校正BMI 后NPY与临床因素的偏相关分析

2.3 组间肠道菌群结构差异 检测两组患者的肠道菌群，经LEfSe共挑选出12个对PCOS组和对照组肠道菌群结构造成差异的关键OTU。两组比较，对照组有9个OTU相对丰度显著增加，主要来自瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、柯林斯菌属(Collinsella)和普氏菌属(Prevotella)等；而PCOS组有3个OTU相对丰度显著增多，主要来自拟杆菌属(Bacteriodes)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)等。见图1和表3。

表3 LEfSe分析特征

红色表示在对照组中丰度增多，绿色表示在PCOS组中丰度增多；条形长短代表显著差异OTU的影响程度图1 两组间关键OTU的LDA值分布图

2.4 肠道菌群与NPY的相关性分析 进一步分析关键OTU丰度与NPY的相关性。校正BMI后，偏相关分析结果显示，NPY与来自霍尔德曼菌属(Holdemanella)、柯林斯菌属和普氏菌属的3个OTU相对丰度均呈显著正相关，与来自毛螺菌科和拟杆菌属的3个OTU相对丰度呈显著负相关(P值分别<0.01,0.05)。见表4。

表4 校正BMI后关键OTU与NPY的偏相关分析

3 讨 论

PCOS是一种育龄期女性常见的复杂内分泌代谢性疾病，其具有终生倾向、全身代谢紊乱的特点，常伴有生殖内分泌功能紊乱、体脂分布异常、糖脂代谢异常和胰岛素抵抗等，而其基本的病理生理变化尚未完全明确，一般认为与遗传和环境因素相关。过去10年中，全基因组关联研究发现，类固醇激素合成、下丘脑-垂体通路、促性腺激素作用、胰岛素分泌及其功能、脂肪组织紊乱、稳态、脂质代谢和慢性炎症都可能是参与PCOS发病的因素[2]。肠道菌群作为人体内庞大的微生物群，其基因组编码的基因数量是人类自身基因组的100～150倍，可被视为人体“内化了的环境”因素，其地位与作用相当于后天获得的一个重要“器官”[17-18]。肠道菌群参与机体代谢和免疫等功能，其紊乱可导致PCOS等多种疾病发生。本研究发现，毛螺菌科在PCOS患者中显著富集，而霍尔德曼菌属和普氏菌属等在PCOS患者中被显著抑制。此外，本课题组的前期研究采用冗余分析(redundancy analysis,RDA)发现，PCOS患者肠道菌群物种丰富度较非肥胖健康女性显著降低，存在显著肠道菌群结构紊乱，并鉴定出28个对4组肠道菌群结构造成差异的关键OTU，拟杆菌属在PCOS患者中显著富集，而疣微菌科和柯林斯菌属在PCOS患者中受到显著抑制[11]。本研究结果与该研究及之前的研究[7,11,19-21]结果相似。

本研究中，PCOS患者NPY水平显著降低，且表现出与LH/FSH、睾酮水平和多毛评分呈负相关关系，推测NPY可能参与调控PCOS生殖内分泌激素的产生。NPY是脑肠肽的一种，与肠道菌群对机体炎症、脑功能和摄食行为等影响有关[21]。NPY/AgRP神经信号通路可以影响促黄体素释放激素(GnRH)/LH脉冲的产生，减少LH分泌[22]。此外，NPY/AgRP神经信号通路可能影响雄激素受体表达[23]。因此，PCOS患者NPY水平降低可能与其生殖内分泌紊乱密切相关。

本研究进一步分析PCOS患者肠道菌群结构与NPY的相关性，发现两者之间存在显著相关关系。目前研究[6-7,11]结果表明，肠道菌群失调或改善可通过调节机体炎症状态、肠-脑轴等途径影响PCOS的发病。根据既往的研究[6,11]得知，肠道菌群可通过富集产短链脂肪酸(SCFA)的细菌产生SCFA，从而促进ghrelin和PYY等分泌，继而作用于宿主肠-脑轴，调节性激素分泌。PYY和NPY作为PP-折叠蛋白家族，前者直接由肠道内分泌细胞分泌，然而肠道菌群如何调控产生NPY，以及两者及机体大脑之间的相互作用有待进一步探讨[21]。本研究发现，在PCOS患者中NPY水平与被抑制的霍尔德曼菌属、柯林斯菌属和普氏菌属等细菌丰度呈显著正相关，而与被富集的毛螺菌科和拟杆菌属丰度呈显著负相关。Narmaki等[13]的研究发现，予多菌株混合益生菌干预后，肥胖女性患者血清NPY水平显著升高。以上提示，肠道菌群中特定菌株可能与人体NPY水平密切相关。

综上所述，PCOS患者血清NPY水平显著降低，且与PCOS患者生殖内分泌紊乱密切相关。PCOS患者肠道菌群中某些特定菌株可能与NPY水平相关。因此，PCOS患者失调的肠道菌群可能通过影响机体NPY水平，进而参与调控机体的病理生理过程，干预PCOS患者肠道菌群结构或NPY水平。上述结论或可为PCOS的临床防治提供新思路。

本研究为PCOS患者肠道菌群结构与NPY相关关系的初步探索，存在一定的局限性：本研究样本量较小，未来需进一步扩大样本量验证该结论；NPY与肠道菌群、大脑之间的相互作用机制仍未明确，有待更加完善的临床和基础研究探讨、阐明。