急性ST段抬高型心肌梗死患者血浆miR-23a-3p、miR-30d与心功能和心肌损伤的关系

吴莎莎 杨帅 沈超 王宗强 吴红栋

急性ST段抬高型心肌梗死(ST segment elevation myocardial infarction，SETMI)是心肌梗死的主要类型，患者因冠状动脉斑块破溃、夹层或裂隙引起冠状动脉血流中断，导致心肌细胞缺血、缺氧，进而出现坏死，心电图表现为ST段抬高，是一种严重的心血管疾病[1]。SETMI患者就诊时多以胸痛为主要临床表现，但患者冠状动脉因血栓导致闭塞，病变急骤，需要与心绞痛鉴别诊断，并给予及时有效的救治。微小RNA(microRNA，miR)是一种内源性非编码的小RNA分子，它可以与靶基因分子3’非编码序列结合，进而调控基因表达，具有广泛的生物学功能[2]。近年来研究发现，多种miR参与了STEMI的发生和发展[3]。miR-23a-3p与心肌病变和心力衰竭的发生有密切关系，而miR-30d与血管损伤和心肌纤维化有密切关系，两者可能对STEMI的预测及心功能、心肌损伤判断具有一定价值[4,5]。本研究探讨STEMI患者血浆miR-23a-3p、miR-30d与心功能和心肌损伤的关系，分析其预测价值，旨在为SETMI的诊断及严重程度判断提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年10月至2020年4月我院收治的STEMI患者62例为STEMI组，同期医院收治的稳定型心绞痛(stable angina pectoris，SAP)74例为SAP组。另选择同期医院体检的健康人60例为健康对照组。STEMI组：62例患者中，男38例，女24例；年龄39～78岁，平均年龄(59.35±8.21)岁；纽约心脏病协会分级(New York Heart Association classification，NYHA)：Ⅰ级17例，Ⅱ级19例，Ⅲ级14例，Ⅳ级12例；吸烟史：有24例，无38例；饮酒史：有22例，无40例，家族遗传史：有34例，无28例；糖尿病18例、高血压33例、高脂血症45例。SAP组：74例患者中，男34例，女40例；年龄38～78岁，平均年龄(58.05±9.12)岁；NYHA：Ⅰ级39例，Ⅱ级26例，Ⅲ级9例；吸烟史：有30例，无44例；饮酒史：有29例，无45例，家族遗传史：有41例，无33例；糖尿病21例、高血压36例、高脂血症49例。健康对照组：60例健康人中，男36例，女24例；年龄38～76岁，平均年龄(59.35±9.34)岁。3组性别比、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①STEMI患者符合《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南》[6]中的诊断标准，SAP患者符合《ACC/AHA慢性稳定型心绞痛诊疗指南修订纲要》中的标准[7]；②患者初次发病，年龄≥18岁；③患者及家属对研究知情同意。

1.2.2 排除标准：①合并肿瘤、急慢性感染、急性脑梗死、脑出血者；②合并严重肝、肾功能障碍者；③既往进行PCI治疗者。

1.3 方法

1.3.1 标本采集:STEMI及稳定型心绞痛患者于入院次日采集空腹肘静脉血6 ml，分装3个试管，2 ml/个，健康对照组于体检当日采集空腹肘静脉血6 ml，分3个试管，每个2 ml，置入EDTA抗凝管中，3 000 r/min离心5 min，分离血浆，-50℃冰箱中保存。

1.3.2 血浆miR-23a-3p、miR-30d检测:取1个试管血浆加入Trizol试剂，试剂盒购自美国Invitrogen公司，通过Trizol法提取血浆总RNA，应用BioPhtometer Plus分光光度计测量总RNA浓度。制备cDNA，反应体系为：血浆RNA 2 μl，反转录酶0.3 μl，核糖核酸酶抑制剂 0.4 μl，引物0.8 μl， 脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)0.4 μl，缓冲液 4 μl，加入焦碳酸二乙酯水至反应体系20 μl，混匀后37℃水浴1 h。然后进行实时定量荧光PCR(Real time quantitative fluorescent PCR，qRT-PCR)反应，内参为U6。反应体系为：cDNA 5 μl， Taq DNA聚合酶0.4 μl，上下游引物1 μl，PCR反应液至25 μl。反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共计40个循环，采用3个复孔，重复3次，采用GenEx 软件分析与 2-ΔΔCT法计算miR-23a-3p、miR-30d相对表达量。

1.3.3 心肌损伤标志物及氨基末端脑钠肽前体(amino terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)检测:取剩余试管血浆，其中1个试管血样应用化学发光法检测血浆乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)、肌钙蛋白I(Troponin I，cTnI)水平，操作在Beckman DX1800全自动免疫分析仪上完成，剩余1个试管血样应用酶联免疫吸附法检测血浆NT-proBNP水平，试剂盒购自上海酶联有限公司，严格按照试剂盒操作。

1.3.4 左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)检测:采用彩色超声多普勒诊断仪(飞利浦IE33)测量3组LVEF。

2 结果

2.1 3组血浆miR-23a-3p、miR-30d水平比较 STEMI组血浆miR-23a-3水平显著低于SAP组、健康对照组，miR-30d水平显著高于SAP组和健康对照组，SAP组血浆miR-23a-3p水平显著低于健康对照组和miR-30d水平显著高于健康对照组，3组miR-23a-3p、miR-30d水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组miR-23a-3p、miR-30d水平比较

2.2 3组心肌损伤标志物、LVEF及NT-proBNP水平比较 STEMI组血浆LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平显著高于SAP组和健康对照组，LVEF显著低于于SAP组和健康对照组(P<0.05)，SAP组NT-proBNP水平高于健康对照组(P<0.05)，SAP组与健康对照组血浆LDH、CK、CK-MB、cTnI、LVEF水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组心肌损伤标志物、LVEF及NT-proBNP水平比较

2.3 不同心功能STEMI患者血浆miR-23a-3p、miR-30d水平比较 随NYHA心功能分级的升高，STEMI患者血浆miR-23a-3p水平逐渐降低，miR-30d、水平逐渐升高，3组间差异比较和趋势分析均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同心功能STEMI患者血浆miR-23a-3p、miR-30d水平比较

2.4 STEMI患者血浆miR-23a-3p、miR-30d水平与心功能及心肌损伤指标的相关性 Pearson相关分析显示STEMI患者血浆miR-23a-3p水平与LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP呈负相关(P<0.05)，与LVEF呈正相关(P<0.05)，miR-30d与水平与LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP呈正相关(P<0.05)，与LVEF呈负相关(P<0.05)。见表4。

2.5 血浆miR-23a-3p、miR-30d对STEMI的预测价值

表4 STEMI患者血浆miR-23a-3p、miR-30d水平与心功能及心肌损伤指标的相关性

2.5.1 两指标的单独应用： 以STEMI患者为阳性样本，稳定性心绞痛患者为阴性样本，建立ROC(receiver operation characteristic，接收者工作特征曲线)诊断分析模型， 并参考临床实践将两指标划分成7～10个组段。经ROC分析知：两指标具有较高的诊断价值，ROC-AUC分别为0.771(0.693～0.858)、0.754(0.614～0.926)。

2.5.2 两指标的联合应用： 采用SPSS软件的联合应用ROC理论模式(LogP模式：对各单独应用指标进行Logistic综合回归，再依据所得OR，归一化加权计算并对应处理各样本资料，并据其进行联合应用的ROC分析)。结果：联合应用对STEMI的预测价值：AUC为0.843(0.739～0.962)。显然其诊断效能均比单一指标均有明显提高。见表5，图1。

表5 血浆miR-23a-3p、miR-30d对STEMI的预测价值之ROC分析结果

图1 血浆miR-23a-3p、miR-30d对STEMI的预测价值的ROC曲线

3 讨论

STEMI是一种重要的心肌梗死类型，占心肌梗死的60%～75%[8]。STEMI发病基础是不稳定粥样斑块，由于粥样斑块破溃、夹层或裂隙等导致冠状动脉急性血栓形成，心肌血供骤然停止，发生缺血缺氧损伤[9]。目前临床主张对于STEMI患者在发病早期即进行介入治疗，迅速疏通阻塞的冠状动脉，以实现血流再通。然而对STEMI的早期诊断一直是临床的难点之一。

近年来，随着分子生物学研究的飞速发展，众多分子生物学标志物被发现。miRNA因参与多种疾病的发生和发展过程，成为多种疾病的重要分子生物学标志物[10]。研究表明，miR可以与靶基因mRNA的3’非编码序列互补结合，从而调控mRNA的表达，进而影响心血管疾病的发生与发展[11]。

目前已有研究显示，miR-23、miR-26、miR-30、miR-133等数十种miR在心脏疾病的发生、发展中起到重要作用[12,13]。其中miR-23a-3p是miR-23家族的重要成员。miR-23a-3p是心肌组织中含量较为丰富的miR之一，miR-23a-3p可以减轻缺血在灌注损伤时心肌细胞的凋亡[14]。研究表明，miR-23a-3p可以降低超氧化物歧化酶引起的氧化应激损伤[15]。既往研究表明miR-30d与心肌细胞损伤有密切关系，miR-30d可以被凋亡基因p53激活，并启动心肌细胞凋亡过程[16]。

本研究通过比较发现，STEMI组血浆miR-23a-3p水平显著低于稳定性心绞痛组、健康对照组，miR-30d水平显著高于稳定型心绞痛组、健康对照组，提示miR-23a-3水平下降，miR-30d水平升高与STEMI发病有关。分析可能与以下机制有关：(1)STEMI发生后心肌细胞死亡，miR-23a-3p起到心肌保护作用而大量消耗，引起血浆miR-23a-3p水平降低；(2)STEMI发生后心肌出现氧化应激损伤，miR-23a-3p降低超氧化物歧化酶引起的心肌氧化应激损过程中大量消耗，导致其水平降低；(3)miR-23a-3p降低心肌细胞凋亡，导致其水平降低；(4)STEMI发生后，p53激活并进一步激活miR-30d，导致血浆miR-30d升高，引起心肌细胞凋亡。

本研究结果显示STEMI组血浆LDH、CK、CK-MB、cTnI、NT-proBNP水平显著高于SAP组、健康对照组。LDH、CK、CK-MB、cTnI是临床上常用的心肌损伤标志物。LDH、CK、CK-MB是重要的催化酶，参与了心肌能量代谢，而cTnI是心肌细胞重要的结构分子，是保证心肌细胞完整性的重要蛋白[17]。当发生心肌损伤时，心肌细胞凋亡，细胞膜破裂，LDH、CK、CK-MB、cTnI释放入血，导致血液中LDH、CK、CK-MB、cTnI水平升高[18]，而SAP患者由于心肌细胞没有发生坏死，因此血浆LDH、CK、CK-MB、cTnI水平与健康对照组比较无统计学差异。NT-proBNP是反映心功能的重要标志物，当心功能降低时NT-proBNP水平升高[19]。

本研究还对不同心功能STEMI患者血浆miR-23a-3p、miR-30d水平进行了比较，结果显示随NYHA心功能分级的升高，STEMI患者血浆miR-23a-3p水平逐渐降低，miR-30d水平逐渐升高。本研究结果表明miR-23a-3p水平和miR-30d水平也可以反映心功能情况，当NYHA心功能分级的升高时，浆miR-23a-3p水平逐渐降低，miR-30d水平逐渐升高。进一步分析显示miR-23a-3p、miR-30d水平与STEMI患者心功能指标和心肌损伤指标有很好的关联。由于miRNA在血液中能够稳定存在，且通过qRT-PCR方法检测miRNA快速、敏感[20]，因此miR-23a-3p、miR-30d可能对STEMI诊断和严重程度评估具有一定价值。本研究显示miR-23a-3p、miR-30d对STEMI预测诊断的价值较高AUC均在0.7以上。两指标联合应用则价值更高，AUC为0.843(0.739～0.962)，提示临床上通过检测血浆miR-23a-3p、miR-30d水平，可以为STEMI诊断判断提供依据。

综上所述，STEMI患者血浆miR-23a-3p水平降低，miR-30d水平升高，其水平与心功能标志物和心肌损伤标志物密切相关，miR-23a-3p、miR-30d对STEMI诊断和评估具有一定价值。