山羊骨调素基因外显子6多态性与繁殖性状相关性研究

范景胜，熊朝瑞，俄木曲者，张 林，许 锋

(1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

母羊繁殖性能是衡量肉羊生产经济效益的重要指标.通常以经产母羊窝产羔数作为繁殖性状的选择指标进行表型选择.但是，母羊的窝产羔数受到环境、营养调控、饲养管理水平等多种因素的影响，且产羔数为低遗传力性状，传统的表型选择选育进展缓慢，效果不明显.人们通过调控母羊发情期的排卵数，来对产羔数进行间接选择，也未取得突破性进展.除母羊发情期的排卵数外，胚胎成活率、母羊子宫长度、胎盘效率等也是影响山羊产羔数的主要因素.胎盘效率(placental efficiency，PE)即胎盘提供营养物质的效率，反应胎盘运输营养物质的能力.1999年Wilson[1]等人最先在猪育种工作中提出这一概念，用出生仔猪窝重与胎盘重之比计算，并将其作为一种育种选择指标.通过对猪[2-9]、绵羊[10-13]、山羊[14-15]胎盘效率与繁殖性状关系的研究发现，胎盘效率随着母畜窝产仔(羔)数的增加，呈上升趋势.

骨调素(Osteopontin，OPN)又称骨桥蛋白，是一种具有多种生物活性的糖基化磷蛋白，最早由骨基质中分离出来，后发现在血管、子宫、胎盘等组织中均有表达[16-17].在哺乳动物生殖系统中，骨调素参与精卵结合、受精卵着床、胎盘形成以及妊娠维持等过程[18]，是近年研究动物繁殖性状的热点之一.本试验以正在培育的肥羔型黑山羊为研究对象，对骨调素基因外显子6多态性进行分析，并研究其与繁殖性状之间的相关性，旨在为研究山羊繁殖性状提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选择体况中等、健康无病的肥羔型黑山羊初产母羊52只、经产母羊156只，共计208只繁殖母羊为研究对象.

1.2 引物设计

试验参考牛OPN基因DNA序列(GenBank登录号:AY878328)和课题组前期研究得到的山羊OPN基因mRNA序列[19]设计肥羔型黑山羊OPN基因外显子6的PCR扩增引物(P1:5'-ACCCTGACACCCATTTT-3'，P2:5'-CAAGATTTACCTGAACG-3')，扩增片段大小预计为350 bp左右.

1.3 试验方法

本实验在肥羔型黑山羊育种场开展，试验羊群营养供给和日常饲养管理，参照肥羔型黑山羊育种核心群进行.母羊妊娠分娩后，记录母羊产羔胎次、窝产羔数、出生窝重等，并收集产羔母羊胎盘，按照范景胜等[14]方法测定计算胎盘重量、子叶个数、子叶总重、胎盘效率、子叶密度和子叶均重等胎盘性状指标.

分别对208只参试母羊颈静脉采血，提取基因组DNA，并利用PCR-SSCP方法对OPN基因外显子6进行基因分型，计算遗传多样性参数；并对不同基因型个体的繁殖性状进行比较分析，研究其多态性与繁殖性状的关系.

2 结果与分析

2.1 能繁母羊的繁殖性能与胎盘性状

对208只参试母羊繁殖性能和胎盘性状进行了分析比较，详见表1、表2.按照母羊不同产羔胎次进行比较，结果显示:初产母羊(52只)与经产母羊(156只)的窝产羔数、出生窝重差异极显著(p＜0.01)，羔羊平均初生重差异不显著；产羔母羊的胎盘重量、子叶总重、子叶个数、子叶密度以及子叶均重，在不同产羔胎次间差异显著或极显著(p＜0.05或p＜0.01)，其中经产母羊的胎盘重、子叶总重和子叶均重高于初产母羊，而子叶个数和密度，则低于初产母羊；经产母羊的胎盘效率高于初产母羊，但差异不显著.

表1 参试母羊繁殖性能及胎盘性状统计结果(X-±SD)Table 1 Statistics of reproductive performance and placental traits of ewes(X-±SD)

表2 不同窝产羔数母羊胎盘性状统计结果(±SD)Table 2 Statistics of placental traits of ewes with different litter size(±SD)

表2 不同窝产羔数母羊胎盘性状统计结果(±SD)Table 2 Statistics of placental traits of ewes with different litter size(±SD)

Ⅰ组(52只) Ⅱ组(97只) Ⅲ组(59只)出生窝重/g 2401.48±89.71A 4671.33±93.28B 7125.42±85.42C羔羊初生均重/g 2401.48±89.71 2335.67±91.32 2302.56±89.21胎盘重量/g 269.31±45.66A 472.89±53.17B 632.44±68.01C子叶总重/g 139.72±1.68aA 267.87±1.23bB 307.44±1.03cB子叶个数/个 119.28±17.34a 101.31±15.36b 90.03±13.02c子叶均重/g 1.17±0.42a 2.64±0.36b 3.41±0.54c子叶密度 0.44±0.04aA 0.21±0.04bB 0.14±0.03cB胎盘效率 8.92±0.87 9.88±0.55 11.27±0.61

按照不同母羊窝产羔数(即产羔类型)，可将参试母羊分为单羔(Ⅰ组)、双羔(Ⅱ组)和多羔(Ⅲ组)3个组别.对3个组进行比较，结果显示:随着窝产羔数的增加，羔羊出生窝重增加，差异极显著(p＜0.01)，但羔羊初生均重差异不显著；随着窝产羔数的变化，母羊的胎盘重量、子叶总重、子叶个数、子叶密度以及子叶均重，呈显著或极显著(p＜0.05或p＜0.01)增加或降低趋势，其中胎盘子叶密度随窝产羔数的增加而降低，单羔组极显著高于双羔和多羔组；不同组别间母羊胎盘效率随窝产羔数的增加而提高，但差异不显著.

2.2 骨调素基因外显子6的PCR-SSCP基因分型

通过对208只参试母羊骨调素基因外显子6的PCR扩增产物进行基因分型，电泳结果显示:有三种带型，分别定义为AA、AB、BB型.根据基因分型结果，随机选择基因型为AA、BB型个体样本各5个，分别将相同基因型个体的OPN基因外显子6PCR扩增产物混合，进行克隆测序.结果显示:PCR扩增基因片段的长度为348 bp，OPN基因外显子6位于扩增片段的39～338 bp.对不同基因型扩增片段的测序序列进行比对，发现存在两个突变位点，分别位于OPN基因外显子6第69 bp(即扩增片段的第107 bp)处的G/C颠换和第84 bp(即扩增片段的第123 bp)处的A/G转换.其中AA型样本的第69 bp处为C、84 bp处为G，而BB型样本对应位点则分别为G、A(详见图1).OPN基因外显子6第69 bp处C→G颠换，使氨基酸序列第97位氨基酸发生改变，由丝氨酸(Serine，Ser，羟基类)突变成精氨酸(Arginine，Arg，碱性氨基酸类)；第84 bp处G→A转换，使氨基酸序列第103位氨基酸发生改变，由天冬氨酸(Aspartic acid，Asp，酸性氨基酸类)突变成天冬酰胺(Asparagine，Asn，酰胺类).

图1 OPN基因外显子6不同基因型序列比对阴影部分表示OPN基因外显子6片段；加粗字体表示突变位点Fig.1 Alignment of sequence of different genotypes in exon 6 of OPN geneThe shaded part represents the exon 6 segment of OPN gene，the bold font indicates the mutation site

2.3 骨调素基因外显子6遗传多样性

对参试母羊的骨调素基因外显子6PCR-SSCP基因分型进行统计，结果显示:208只参试母羊中，AA型个体有76只，AB型83只，BB型49只.外显子6基因型频率和等位基因频率详见表3.对参试羊群OPN基因外显子6进行卡方检验，结果显示该基因在肥羔型黑山羊群体中未处于Hardy-Weinberg平衡状态(p＜0.01).肥羔型黑山羊培育已经过了四个世代的选育，持续的人工选择可能导致该基因位点上偏离了Hardy-Weinberg平衡状态.

表3 OPN基因外显子6基因型频率和等位基因频率统计结果Table 3 Genotype and allele frequencies of exon 6 of OPN gene

通过计算遗传多样性参数，对参试羊群的OPN基因外显子6遗传变异情况进行分析，结果显示:肥羔型黑山羊外显子6的多态信息含量PIC值为中度多态(0.25＜PIC＜0.5)，表明在该位点有较大的选择空间(详见表4).在肥羔型黑山羊培育过程中，主要选择指标为早期生长性状，繁殖性状与其相比，选择压力相对较小.

表4 肥羔型黑山羊OPN基因外显子6遗传变异分析Table 4 Analysis of genetic variation in exon 6 of OPN gene of fat-lamb goats

2.4 山羊骨调素基因多态性与山羊繁殖性能的相关性

对不同基因型肥羔型黑山羊个体的繁殖性状、胎盘性状指标差异，采用最小二乘方差分析法进行分析，结果见表5.不同纯合子基因型个体间的各项性状指标差异显著(p＜0.05)，其中胎盘效率、胎盘重量、子叶总重、窝产羔数均为BB型＞AA型个体，而子叶密度则反之.表明山羊的胎盘性状和窝产羔数受OPN基因外显子6多态性影响显著，该多态位点可能是影响山羊繁殖性能的分子标记.此外，以基因型分组，不同组别间的各项性状指标比较，也可反映出随着母羊窝产羔数的增加，胎盘效率呈上升趋势.

表5 OPN基因外显子6不同基因型繁殖母羊繁殖性状最小二乘均数Table 5 Least square means for reproductive traits ofewes with different genotypes in exon 6 of OPN gene

3 讨论

Wilons等[1]于1999年首次研究发现母猪的窝产仔数与胎盘效率呈正相关关系，并将其作为选择指标，并应用于猪的育种.山羊、绵羊均为子叶型胎盘，母体和胎儿之间通过子叶传递营养物质.本试验对208只肥羔型黑山羊能繁母羊的胎盘性状进行分析，结果发现:肥羔型黑山羊的胎盘重量、子叶总重量等指标，经产母羊均高于初产母羊，而子叶数量、子叶密度则相反；母羊窝产羔数增加，其胎盘效率随之提高，而子叶密度则随之降低.这与国内外在绵羊、山羊方面的有关研究结果基本一致[12-15，20]，均证实了妊娠母羊是通过增大胎盘子叶的重量来提升胎盘效率，从而保障胎儿的营养供给[21].

骨调素在哺乳动物生殖系统中，受孕激素的调控，并参与调控“子宫—胎盘”微循环，在胚胎着床和妊娠维持过程中发挥作用.骨调素基因是近年关联动物繁殖性状的热点候选基因之一.研究已经证实猪骨调素基因启动子区域、第6内含子的多态性与其产仔数、产仔成活率等繁殖性状相关[22-23].但对于OPN基因外显子多态性的研究报道较少.毛建文[20]研究发现，OPN基因外显子7多态性显著影响山羊的窝产羔数、胎盘效率.谢畅[14]以乐至黑山羊为研究对象，对OPN基因部分外显子多态性分析发现，外显子6存在SNP位点，但呈低度多态，未引起氨基酸结构改变，且对母羊胎盘效率和繁殖性能的影响均不显著.

本试验结果与谢畅的研究结果不同，在OPN基因外显子6检测到的第69 bp处存在G/C颠换、第84 bp处存在A/G转换，均引起了氨基酸位点发生变化；外显子6基因多态性显著影响肥羔型黑山羊胎盘性状、窝产羔数等繁殖性状.这可能与选择的山羊品种不同有关.乐至黑山羊经产母羊产羔率达到250%以上，长期的自然选择使OPN基因外显子6在该群体中相对保守.肥羔型黑山羊经产母羊产羔率为213%左右.该群体培育过程中，对繁殖性状的育种选择压力较小，OPN基因外显子该6还有较大的选择空间，表明肥羔型黑山羊的繁殖性能通过加强选育，还可以进一步提升.

4 结论

本试验通过对208只肥羔型山羊能繁母羊的胎盘性状研究分析发现，母羊的胎盘效率随着窝产羔数的增加而提高，子叶密度随窝产羔数的增加而降低；OPN基因外显子6多态性显著影响山羊的繁殖性状.但山羊的繁殖性状受环境、饲养管理、营养水平等非遗传因素的影响较大，还需进一步扩大样本量进行研究.