芎附滴丸质量控制及抗偏头痛药效学研究

王敏　吴莎　郭丽　王晶　李明聪　刘荣　刘攀婷　肖航　骆思源

摘要 目的：建立芎附滴丸（XFDP）的质量标准，并对其进行抗偏头痛的药效学研究。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定XFDP中8种主要成分的含量。评价XFDP对偏头痛大鼠5-羟色胺（5-HT）、β-内啡肽（β-EP）、降钙素基因相关肽（CGRP）、内皮素-1（ET-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB（NF-κB）、一氧化氮合酶（NOS）含量，及Calca、c-fos mRNA表达的影响。结果：建立的HPLC法线性关系、精密度、重复性、稳定性良好，各成分的平均加样回收率和相应的RSD分别为阿魏酸100.68（2.76%）、洋川芎内酯I 98.71（2.88%）、洋川芎内酯A 101.66（2.17%）、丁基苯酞100.15（2.60%）、Z-藁本内酯99.50（2.88%）、Z-丁烯基苯酞102.47（2.22%）、香附烯酮100.11（2.91%）、α-香附酮100.66（3.03%）。偏头痛造模后大鼠5-HT、β-EP含量显著降低（P<0.01，P<0.01），CGRP、ET-1、MMP-9、核因子κB、NOS含量显著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01），Calca、c-fos mRNA的表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。XFDP可升高模型大鼠5-HT、β-EP含量，降低CGRP、ET-1、MMP-9、核因子κB、NOS含量，降低Calca、c-fos mRNA的表达，而发挥治疗偏头痛的作用。结论：本方法简单、快速、准确，可用于XFDP的质量控制;XFDP通过调节多种神经递质和血管活性物质的表达发挥治疗偏头痛的作用。

关键词 芎附滴丸;偏头痛;药效学;高效液相色谱法

Abstract Objective：To establish quality standards and evaluate the anti-migraine effect of Xiongfu dripping pills.Methods：A HPLC method was used for simultaneous determination of 8 main components in Xiongfu dripping pills.The effects of Xiongfu dripping pills on the contents of 5-HT，β-EP，CGRP，ET-1，MMP-9，NF-κB，NOS and the mRNA expression of Calca and c-fos in migraine rats were evaluated.Results：The HPLC-DAD method determined the content of ferulic acid，senkyunolide I，senkyunolide A，3-butylphthalide，Z-ligustilide，Z-butylidenephthalide，cyperotundone and α-cyperone.The precision，repeatability and stability were favorable.The average recoveries and corresponding RSD values were 100.68（2.76%）、98.71（2.88%）、101.66（2.17%）、100.15（2.60%）、99.50（2.88%）、102.47（2.22%）、100.11（2.91%）、100.66（3.03%），respectively.Compared to normal rats，the levels of 5-HT and β-EP in migraine rats decreased significantly（P<0.01，P<0.01），CGRP，ET-1，MMP-9，NF-κB and NOS increased significantly（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01），and the mRNA expression of Calca and c-fos also increased significantly（P<0.05，P<0.01）.Xiongfu dripping pills significantly improved 5-HT and β-EP，reduced CGRP，ET-1，MMP-9，NF-κB，NOS and reduced the mRNA expression of Calca and c-fos to treat migraine.Conclusion：The HPLC method is simple，fast，accurate，and it can be used for the quality control of Xiongfu dripping pills.Xiongfu dripping pills treat migraine by regulating various neurotransmitters and vasoactive substances.

Keywords Xiongfu dripping pills; Migraine; Pharmacodynamics; HPLC

中圖分类号：R289.5;R541文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.004

偏头痛是一种高发病率、反复发作的慢性功能障碍性疾病，全球偏头痛发病率约11%[1]。近年来偏头痛呈现日益上升的趋势，严重影响着人们的身体健康与生命质量。芎附方出自《丹溪心法》，由川芎、香附两味中药配伍组成，治气厥头痛、偏正头痛。方中川芎上行头目，下行血海，为血中之气药，善活血行气，祛风止痛。香附为气病之总司，女科之主帅，善行气化瘀、调经止痛。临床实践证明川芎-香附配伍可治疗偏头痛[2-3]，现代药理实验亦证明芎附方可通过调节5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸、多巴胺、一氧化氮合酶、降钙素基因相关肽等而发挥治疗偏头痛的作用[4-6]。本课题组前期实验将芎附方开发为芎附滴丸（XFDP）用于芎附方的临床应用。本实验通过采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）同时检测XFDP中8种有效成分的含量，并进行XFDP抗偏头痛的药效学实验，以期为XFDP的质量控制和药效学评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取SPF级SD雄性大鼠36只，体质量（200±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK（京）2016-0011。实验动物饲养于温度25 ℃、湿度50%的屏障环境中。

1.1.2 药物 川芎饮片（北京鹤延龄药业发展有限公司，批号：170604）。

1.1.2 仪器与试剂 台式多功能实验滴丸机（北京正大绿洲制药有限公司，型号：TDSJ-A）;高效液相色谱系统（Agilent公司，美国，型号：Agilent 1100）;全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国，型号：Multiskan Go）;自动洗板机（Bio-rad公司，美国，型号：Bio-Plex Pro Ⅱ）;超微量紫外分光光度计（JENWAY公司，英国，型号：Genova Nano）;凝胶成像仪（GE公司，美国，型号：Image Quant 3500）;实时荧光定量PCR仪（Bio-rad公司，美国，型号：CFX connect）。醋香附饮片（北京人卫中药饮片厂，批号：17022102）;阿魏酸（中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614）;洋川芎内酯I（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21463）;洋川芎内酯A（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS170418-03）;丁基苯酞（上海源叶生物科技有限公司，批号：B21649）;Z-藁本内酯（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS0322-0100）;Z-丁烯基苯酞（批号：B20300，上海源叶生物科技有限公司）;香附烯酮（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS010769）;α-香附酮（成都普思生物科技股份有限公司，批号：PS010758），上述对照品纯度均在98%以上;琥珀酸舒马普坦片（天津华津制药有限公司，批号：7B6926T），硝酸甘油注射液（北京益民药业有限公司，批号：20170808）;TRIZOL.试剂（Invitrogen公司，美国，货号：15596026）;Fastking RT Kit（with.gDNase，货号：KR116-02）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green，货号：FP-205-02）均购于天根生化科技北京有限公司;5-羟色胺试剂盒（批号：20180531）、降钙素基因相关肽试剂盒（批号：20180531）、β-内啡肽试剂盒（批号：20180531）、内皮素-1试剂盒（批号：20180531）、基质金属蛋白酶-9（批号：20180531）、核因子κB试剂盒（批号：20180531）、总一氧化氮合成酶NOS试剂盒（批号：20181009）均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 XFDP的制备 取川芎62.5 g用90%乙醇浸渍，醋香附125.0 g用85%乙醇浸渍，再分别用16倍量乙醇进行渗漉，收集渗漉液，回收乙醇，药液浓缩至相对密度1.20～1.30（50 ℃）的稠膏。稠膏与基质PEG 6000（1∶2）混合，加热熔融后，倒入滴丸机储药罐中，滴入装有二甲基硅油的滴筒罐中，冷却固化成丸，吸干冷却剂，即得XFDP。用同样的方法制备空白滴丸。

2.2 XFDP中主要成分的含量测定

1.2.2 色谱条件 采用Kromasil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱：0～10 min，10%～30% A;10～25 min，30%～35%A;25～45 min，35%～55% A;45～48 min，55%～65% A;48～75 min，65%～75%A;75～90 min，75%～80% A;流速为1.0 mL/min;进样量10 μL;柱温25 ℃;检测波长为250 nm和286 nm。

1.2.3 混合对照品溶液的制备 将阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、丁基苯酞、Z-藁本内酯、Z-丁烯基苯酞、香附烯酮和α-香附酮，分别精密称取1.750 mg、1.405 mg、37.975 mg、2.503 mg、50.951 mg、1.925 mg、5.425 mg、1.475 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、丁基苯酞、Z-藁本内酯、Z-丁烯基苯酞、香附烯酮和α-香附酮浓度分别为0.070 mg/mL、0.056 mg/mL、1.519 mg/mL、0.100 mg/mL、2.038 mg/mL、0.077 mg/mL、0.217 mg/mL和0.059 mg/mL的混合对照品储备液。

1.2.4 供试品溶液的制备 取XFDP约0.5 g，研细后精密称重，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇5 mL，称重，超声30 min至室温，用甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

1.2.5 偏头痛药效学实验 雄性SD大鼠按体质量随机分为空白对照组、模型对照组、阳性药组[琥珀酸舒马普坦5.83 mg/（kg·d）]、XFDP低剂量组[含滴丸1.0 g/（kg·d）]、XFDP中剂量组[含滴丸1.5 g/（kg·d）]、XFDP高剂量组[含滴丸3.0 g/（kg·d）]，每组动物6只。实验前适应性饲养大鼠后，按10 mL/kg体质量剂量连续灌胃给药5 d，灌胃1次/d。空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水，给药组灌胃XFDP。第5天给药后30 min，于大鼠额区皮下注射硝酸甘油注射剂10 mg/kg。造模后2 h，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉后，腹主动脉取血，分离血清。取血后脱颈椎处死，分离脑干，冻实。

1.2.6 5-羟色胺（5-HT）、降钙素基因相关肽（CGRP）、β-内啡肽（β-EP）、内皮素-1（ET-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB（NF-κB）、一氧化氮合酶（NOS）含量测定 酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定左侧脑干5-HT、CGRP、β-EP、ET-1、MMP-9、NF-κB含量，测定血清中NOS活力。

1.2.7 Calca和c-fos mRNA进行相对表达量分析Trizol法提取右侧脑干中总RNA。取1 μg总RNA模板，按照快速反转录试剂盒说明书配成20 μL反应体系合成第一链cDNA，以GAPDH基因为内参基因，引物设计见表1。反应條件为42 ℃，15 min，95 ℃，3 min。取0.8 μL cDNA模板，上下游引物各0.6 μL，按照扩增试剂盒说明书配成20 μL反应体系进行扩增，PCR热循环参数：1）预变性：1X，95 ℃，15 min;2）PCR：40X，95 ℃，10 s，52 ℃，20 s，72 ℃，30 s;3）熔解曲线分析：每个样本平行设置3个复孔，对各样本的Calca和c-fos mRNA进行相对表达量分析，采用2-△△ct法分析结果。引物序列见表1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XFDP中主要成分的含量测定

2.1.1 线性关系考察 以质量浓度（μg/mL）为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算线性回归方程、相关系数及线性范围。见表2。

2.1.2 专属性试验 混合对照品溶液、XFDP供试品溶液和空白滴丸基质溶液的色谱图见图1。XFDP中共检测了8种成分，空白滴丸基质中没有上述8种成分对应的色谱峰，说明空白滴丸基质对上述成分的测定无干扰。见图1。

2.1.3 精密度试验 8个成分含量的RSD值，依次为阿魏酸1.64%，洋川芎内酯I 1.57%，洋川芎内酯A 1.20%，丁基苯酞0.34%，Z-藁本内酯1.24%，Z-丁烯基苯酞1.29%，香附烯酮1.31%，α-香附酮1.37%，说明仪器精密度良好。

2.1.4 重复性试验 8个成分含量的RSD值依次为阿魏酸2.90%，洋川芎内酯I 1.43%，洋川芎内酯A 2.96%，丁基苯酞0.53%，Z-藁本内酯2.09%，Z-丁烯基苯酞2.10%，香附烯酮2.68%，α-香附酮2.92%，说明该方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验 8个成分含量的RSD值依次为阿魏酸2.90%，洋川芎内酯I 2.06%，洋川芎内酯A 2.25%，丁基苯酞0.39%，Z-藁本内酯2.39%，Z-丁烯基苯酞2.07%，香附烯酮2.64%，α-香附酮2.04%，结果表明上述供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.6 加样回收率试验 各成分的平均加样回收率和相应的RSD分别为阿魏酸100.68（2.76%）、洋川芎内酯I 98.71（2.88%）、洋川芎内酯A 101.66（2.17%）、丁基苯酞100.15（2.60%）、Z-藁本内酯99.50（2.88%）、Z-丁烯基苯酞102.47（2.22%）、香附烯酮100.11（2.91%）、α-香附酮100.66（3.03%）。见表3。

2.1.7 XFDP含量测定 6批XFDP中8种成分的平均含量分别为阿魏酸0.44 mg/g、洋川芎内酯I 0.18 mg/g、洋川芎内酯A 2.55 mg/g、丁基苯酞0.23 mg/g、Z-藁本内酯21.00 mg/g、Z-丁烯基苯酞0.17 mg/g、香附烯酮1.05 mg/g、α-香附酮0.21 mg/g。见表4。

2.2 5-HT、β-EP、CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS测定结果 与空白对照组比较，模型对照组大鼠5-HT、β-EP含量均显著降低（P<0.01，P<0.01），含量显著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。与模型对照组比较，阳性药组5-HT、β-EP含量均显著升高（P<0.01，P<0.01），CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量显著降低（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。与模型对照组比较，XFDP低剂量组可显著升高5-HT、β-EP含量（P<0.01，P<0.01），显著降低CGRP、MMP-9、NF-κB、NOS含量（P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01），虽可降低ET-1含量但差异无统计学意义。与模型对照组比较，XFDP高、中剂量组均可显著升高5-HT、β-EP含量（P<0.01，P<0.01），显著降低CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量（P<0.01，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）。结果说明，XFDP可通过升高脑干中5-HT、β-EP含量，降低脑干中CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB含量，降低血清中NOS含量，而发挥抗偏头痛作用。见表5。

2.3 Calca、c-fos mRNA测定结果 与空白对照组比较，模型对照组大鼠Calca、c-fos mRNA的表达均显著升高（P<0.05，P<0.01）。与模型对照组比较，阳性药组Calca、c-fos mRNA的表达均显著降低（P<0.05，P<0.05）。与模型对照组比较，XFDP低、中、高剂量组可显著降低Calca、c-fos mRNA的表达（P<0.05，P<0.05）。结果说明，XFDP可通过降低脑干中Calca、c-fos mRNA的表达而发挥抗偏头痛作用。见表6。

3 讨论

偏头痛的发病机制主要有三叉神经血管反射学说、皮质扩布性抑制学说和血管源学说[7]。基于这3种学说，本实验采用了硝酸甘油致偏头痛大鼠模型，选取了5-HT、CGRP、β-EP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS等观察指标，研究XFDP抗偏头痛的效果。

5-HT是中枢内源性镇痛系统的重要神经活性物质之一。偏头痛发作前期，中枢神经系统5-HT释放增加，导致血管扩张和硬脑膜蛋白外渗[8-9]。CGRP是广泛存在于中枢及外周神经系统的神经肽，由Calca基因编码，具有很强的扩血管作用[10]。研究发现CSD模型大鼠血浆CGRP明显增加[11]。头痛发作时，偏头痛患者血浆CGRP水平升高，且CGRP水平與头痛强度、持续时间正比[12]。β-EP是主要的镇痛递质，β-EP释放减少将导致神经系统对外界刺激敏感度增强，从而引发偏头痛[13]。ET是由21个氨基酸组成的血管收缩肽，在正常生理情况下，ET和CGRP处于动态平衡状态，偏头痛发作期患者血浆中血管活性物质CGRP、ET含量异常，颅内血管舒缩功能失衡[14]。偏头痛发作会触发三叉神经感觉纤维释放神经肽，引起神经源性炎症，使MMP-9上升[15]。偏头痛患者血浆中MMP-9含量远高于正常对照组[16]。NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的基因多向性转录因子，电刺激大鼠上矢状窦区硬脑膜，可激活中脑导水管周围灰质区核因子κB细胞[17]。NO是偏头痛发病机制中的一个关键分子，NO可通过谷氨酸通路及降钙素基因相关肽引起血管扩张和神经源性炎症反应，产生血管扩张性头痛[18]。NO由NOS产生，因此实验中选择检测血清中NOS的活性。研究证实c-fos基因异常表达与偏头痛存在密切关系，偏头痛发作期时增强三叉神经核尾部内的c-fos基因表达，用舒马曲坦或麦角胺治疗后，c-fos表达受到抑制[19-20]。因此，实验选择采用ELISA测定给药前后偏头痛大鼠5-HT、CGRP、β-EP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量的变化，采用qPCR测定Calca、c-fos mRNA表达的变化，以评价XFDP抗偏头痛的作用。

实验结果显示，XFDP可升高偏头痛大鼠5-HT、β-EP含量，降低CGRP、ET-1、MMP-9、NF-κB、NOS含量，降低Calca、c-fos mRNA的表达，而发挥治疗偏头痛的作用。XFDP通过调节多种神经递质和血管活性物质的表达发挥治疗偏头痛的作用[21]。

参考文献

[1]Spierings EL，Padamsee A.Menstrual-Cycle and Menstruation Disorders in Episodic vs Chronic Migraine：An Exploratory Study[J].Pain Med，2015，16（7）：1426-1432.

[2]来丽丽，范红晶，张宇燕，等.川芎用药配伍规律探析[J].中华中医药学刊，2015，33（10）：2335-2337.

[3]程敏.川芎-香附药对源流及功用初探[J].时珍国医国药，2011，22（6）：1420-1421.

[4]赵学军，奇锦峰，李卫民，等.芎附正天软胶囊治疗偏头痛的镇痛药效学研究[J].中药新药与临床药理，2005，16（5）：346-348.

[5]李春晓，陈丹，马项雨，等.偏头痛预防性治疗新药人源化单克隆抗体galcanezumab[J].中国新药杂志，2020，29（3）：254-257.

[6]吴莎，郭丽，许永崧，等.药对川芎-香附对硝酸甘油偏头痛大鼠单胺类神经递质、一氧化氮和一氧化氮合酶的影响[J].中华中医药学刊，2018，36（9）：2110-2112.

[7]韩芳，李双，孙凡，等.偏头痛的现代医学治疗现状[J].中西医结合心脑血管病杂志，2016，14（1）：42-47.

[8]Srikiatkhachorn A，Anuntasethakul T，Phansuwan-Pujito P，et al.Effect of serotonin depletion on nitric oxide induced cerebrovascular nociceptive response[J].Neuroreport，2001，12（5）：967-971.

[9]Charles A.Defining and refining 5-HT receptor targets for migraine[J].Lancet Neurol，2012，11（5）：383-384.

[10]Conner AC，Simms J，Barwell J，et al.Ligand binding and activation of the CGRP receptor[J].Biochem Soc Trans，2007，35（Pt 4）：729-732.

[11]邱恩超，于生元，李凤鹏，等.皮层扩布性抑制对血浆降钙素基因相关肽与P物质的影响[J].中国疼痛医学杂志，2014，20（6）：379-382.

[12]Sutherland HG，Buteri J，Menon S，et al.Association study of the calcitonin gene-related polypeptide-alpha（CALCA） and the receptor activity modifying 1（RAMP1） genes with migraine[J].Gene，2013，515（1）：187-192.

[13]杨晓苏，杨期东.偏头痛患者血浆β-内啡肽含量的研究[J].临床神经病学杂志，1996，9（1）：28-30.

[14]王永久，刘坤，由振东.神经肽与偏头痛研究进展[J].国际神经病学神经外科学杂志，2006，33（2）：157-159.

[15]Martins-Oliveira A，Gonalves FM，Speciali JG，et al.Specific matrix metalloproteinase 9（MMP-9） haplotype affect the circulating MMP-9 levels in women with migraine[J].J Neuroimmunol，2012，252（1-2）：89-94.

[16]Leira R，Sobrino T，Rodríguez-Yáez M，et al.Mmp-9 immunoreactivity in acute migraine[J].Headache，2007，47（5）：698-702.

[17]孙宁，崔红生，于文晓，袁芳.中风回春片在血管神经性头痛治疗中的应用效果及安全性[J].中国医药，2021，16（5）：717-720.

[18]Uzar E，Evliyaoglu O，Toprak G，et al.Increased asymmetric dimethylarginine and nitric oxide levels in patients with migraine[J].J Headache Pain，2011，12（2）：239-243.

[19]Berridge M.Second messenger dualism in neuromodulation and memory[J].Nature，1986，323（6086）：294-295.

[20]Tassorelli C，Joseph SA.Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat[J].Brain Res，1995，682（1-2）：167-181.

[21]郑全成，刘建浩，张宇，等.半夏白术天麻汤加减联合针刺治疗偏头痛风痰上扰证的观察[J].中国实验方剂学杂志，2021，27（3）：111-116.

（2020-04-18收稿 责任编辑：杨觉雄）