环状RNA circMICRA在冠心病患者外周血中的差异性表达*

张 帅，刘志坚，冯倚帆，宋子威，李世宝,2△

1.徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州 221002；2.徐州医科大学医学技术学院，江苏徐州 221002

冠心病(CAD)是最常见的心血管疾病，其发病率逐年增高并有年轻化的趋势。心血管疾病死亡率位居世界疾病谱首位，约占全球总死亡人数的31%[1]。随着人口老龄化和CAD风险因素负担的日益增加，预计到 2030年世界范围内每年将有超过2 000万人死于急性心肌梗死、卒中及其他心血管疾病[2]。依据《中国心血管健康与疾病报告2019》，现患心血管疾病人数约有3.3亿人，其中CAD患者就有1 100万，而且自2005年开始，急性心肌梗死病死率呈快速上升趋势。环状RNA呈闭合环状结构，具有高度稳定性、组织器官表达特异度、广泛分布性，可在基因转录和表达等多层面发挥调节作用，已成为疾病的新型生物学标志及潜在的调控靶点[3]。本研究检测并比较了心肌梗死相关环状RNA(circMICRA、circCDR1AS、circZNF292)在CAD患者和健康人群中的表达改变，探究其在冠心病病理过程中可能发挥的作用，以期为CAD的防治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年10月至2019年11月期间在徐州医科大学附属医院(下称本院)就诊的男性CAD患者58例作为CAD组，平均年龄(57.1±3.7)岁。选择同期在本院进行健康体检的47例男性体检健康者作为对照组，平均年龄(57.3±3.1)岁。CAD组的纳入标准：冠状动脉主要血管及其分支狭窄超过50%。排除标准：(1)心源性疾病，如先天性心脏病、心脏瓣膜病、急性心力衰竭等；(2)系统性疾病，如恶性肿瘤、自身免疫性疾病、严重肝肾疾病等。对照组为同期进行健康体检的无CAD疾病者，排除标准与CAD组相同。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有研究对象对本研究内容知情并签署知情同意书。

1.2标本及临床资料收集 收集所有研究对象的2 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血，按1∶3的比例加入红细胞裂解液，充分裂解后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；弃上清液，加入1 mL Trizol试剂，-80 ℃条件下保存备用。收集以下临床资料：年龄、性别、身高、体质量、体质量指数(BMI)、血压、空腹血糖水平(FPG)、血脂水平、吸烟史(有/无)、饮酒史(有/无)、原发性高血压史(有/无)、糖尿病史(有/无)、高脂血症病史(有/无)、冠状动脉造影报告以及血常规结果(中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板)计数等。

1.3冠状动脉粥样硬化严重程度评估 采用Gensini得分评估冠状动脉粥样硬化严重程度。Gensini评分主要包括两方面：(1)对冠状动脉狭窄的程度进行评分，狭窄小于25%为1分；25%～<50%为2分；50%～<75%为4分；75%～<90%为8分；90%～<100%为16分；100%为32分；(2)Gensini评分系统把冠状动脉分为15节段，根据冠状动脉不同节段的供血区域及生理意义，赋予冠状动脉各节段不同的权重系数。各节段评分与对应系数乘积累积求和即为最终的Gensini得分。

1.4系统性炎症标志物计算 收集外周血血常规结果，根据中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和血小板计数，计算系统性炎症指标：中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、血小板与淋巴细胞比值(PLR)以及单核细胞与淋巴细胞比值(MLR)。

1.5总RNA提取及逆转录 采用Trizol试剂进行外周血总RNA提取。Thermo Nanodrop 2000C分光光度计检测RNA纯度，理想纯度为A260/A280比值为1.8～2.0，A260/A230比值为2.0～2.2。本实验采用TOYOBO公司ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒进行RNA逆转录反应。逆转录合成的cDNA置于-80 ℃条件下保存备用。

1.6实时定量PCR(qPCR)检测 qPCR所采用的的引物由Primer premier 5.0软件设计，选用GAPDH基因为内参基因。引物序列信息见表1。qPCR选用20 μL反应体系，包括SYBR Green Mix 10.0 μL、10 μmol/L上游引物1.0 μL、10 μmol/L下游引物1.0 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O 7.0 μL。反应条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循环40次。每个cDNA样本均设置两个副孔。采用2-ΔΔCt法计算相对表达水平。

表1 引物序列及产物长度

2 结 果

2.1研究人群的基本特征 如表2所示，CAD组和对照组均为男性，两组年龄差异无统计学意义[(57.1±3.7)岁vs.(57.3±3.1)岁，P=0.803]。与对照组相比，CAD组具有较高的BMI水平、饮酒率、高血压患病率、糖尿病患病率和高脂血症患病率，但差异均无统计学意义(P>0.05)，吸烟率在两组间差异有统计学意义(P<0.001)。

表2 研究人群临床特征比较

2.2circMICRA与CAD风险因素的相关性 将CAD组和对照组合并后进行Spearman相关分析，结果显示circMICRA表达水平与吸烟(r=-0.335，P<0.001)和高血压(r=-0.371，P<0.001)呈负相关。线性回归模型在校正年龄、BMI水平、吸烟、饮酒、糖尿病和高脂血症等因素后，circMICRA表达水平仍与高血压呈负相关(β=-0.337，P=0.001)。以纳入对象的年龄和BMI的平均值为界值以及是否具有吸烟、饮酒、高血压、糖尿病和高脂血症相关病史，将所有研究对象按上述临床参数的不同各分为两组，经t检验分析，circMICRA表达水平在组间的差异，分析结果进一步证实了circMICRA表达水平与吸烟、高血压因素相关(P<0.05)，见表3。

表3 circMICRA在亚组中的表达差异

2.3circMICRA在CAD组中表达降低 circMICRA表达水平经对数转化后符合正态分布。与对照组相比，circMICRA表达水平在CAD组中显著降低(-0.346±0.327vs.-0.125±0.197，P<0.001)，见图1A。使用Logistic回归进一步分析circMICRA在冠心病中的作用，结果显示在校正年龄、BMI、吸烟率、饮酒率、高血压患病率、糖尿病患病率和高脂血症患病率后，circMICRA表达能降低CAD发病风险(OR=0.031，95%CI：0.004～0.251，P=0.001)。环状RNA circCDR1AS表达水平(-0.505±0.421vs.-0.374±0.278，P=0.061)和circZNF292表达水平(-0.093±0.399vs.-0.114±0.205，P=0.731)在CAD组和对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1A。

图1 circMICRA在CAD组、对照组、低Gensini组和高Gensini组的表达水平

2.4circMICRA表达水平与冠状动脉粥样硬化严重程度的关系 Spearman相关分析显示，circMICRA表达水平与Gensini得分呈负相关(r=-0.391，P=0.002)，见图2A。以Gensini得分的中位数为界值，把CAD患者分为两组：高Gensini得分组(>71.5)和低Gensini得分组(≤71.5)。t检验分析显示，高Gensini得分组的circMICRA表达水平显著低于低Gensini得分组，差异有统计学意义(-0.488±0.317vs.-0.239±0.296，P=0.003)，进一步揭示了circMICRA表达水平与冠状动脉粥样硬化严重程度有关，见图1B。

2.5circMICRA表达水平与炎症指数的关系 依据外周血血常规检查结果计算CAD患者的炎症指数：NLR、PLR及MLR。Spearman相关分析显示，circMICRA表达水平与NLR(r=-0.367,P=0.005)和PLR(r=-0.403,P=0.002)呈负相关，提示circMICRA可能作为炎症相关因子参与CAD过程。circMICRA表达水平与MLR不相关(r=-0.165,P=0.215)，见图2B和2C。

图2 circMICRA表达水平与Gensini得分、NLR和PLR的相关性

3 讨 论

随着居民生活水平的提高，不健康生活方式的流行和社会老龄化，我国居民动脉粥样硬化性心血管病(ASCVD)呈现低龄化、快速增长趋势。目前，ASCVD位居我国死亡原因的首位，占居民疾病死亡构成比的40%以上[4]。《中国卫生和计划生育统计年鉴》统计结果显示，2012年以来，中国居民CAD死亡率有持续上升趋势。CAD是遗传因素与环境因素共同作用下的复杂性疾病，其中遗传因素是引发CAD的主要因素之一。鉴定CAD的遗传因素并研究其在疾病发生发展中的作用，对CAD的防治具有重大意义。

越来越多的研究显示，环状RNA与心血管疾病的发生密切相关，第一个被发现与心血管疾病相关的环状RNA是心脏相关环状RNA circHRCR，其通过抑制miRNA-223活性可减缓心肌肥厚和心力衰竭的发展[5]。小鼠心肌梗死模型研究发现，环状RNA circCDR1AS的过表达能够加重心肌细胞凋亡程度，加大心肌梗死面积[6]。SONG等[7]还发现，circANRIL表达下调显著降低TC、TG、LDL等血脂水平以及C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-6等炎症因子的表达，减缓血管内皮细胞凋亡，发挥抗动脉粥样硬化的作用。心肌细胞系研究显示，环状RNA circZNF292靶向作用于BNIP3基因，可减缓缺氧性心肌损伤，环状RNA circZNF292调节内皮细胞和心肌细胞增殖和凋亡，影响血管内皮细胞生理功能，进而参与心血管疾病的发展[8-9]。

circMICRA(hsa_circ_0000615)为心肌梗死相关环状RNA由位于人类基因组chr15:64791491-64792365的锌指蛋白609(ZNF609)基因的外显子反向剪接而成。本研究发现，与对照组相比，circMICRA表达水平在CAD组中显著降低，差异有统计学意义(-0.346±0.327vs.-0.125±0.197，P<0.001)。Logistic回归的进一步分析显示，在校正年龄、BMI、吸烟率、饮酒率、高血压患病率、糖尿病患病率和高脂血症患病率后，circMICRA表达能降低CAD发病风险(OR=0.031，95%CI：0.004～0.251，P=0.001)。本研究也揭示了circMICRA表达水平与冠状动脉粥样硬化严重程度呈负相关，即高Gensini得分组的circMICRA表达水平显著低于低Gensini得分组。ANTONIO等[10]研究发现，环状RNA circMICRA表达水平在严重心肌梗死患者外周血中显著降低，与本研究结果一致。LIU等[11]研究发现，circMICRA在CAD患者外周血中表达下调，进而通过糖尿病血管内皮细胞实验证实，circMICRA与 miR-615-5p相互作用影响血管内皮细胞迁移和凋亡，导致血管内皮功能紊乱，进而参与动脉粥样硬化的发展。有研究发现，circMICRA能够竞争性结合miR-145-5p，可通过调控miR-145-5p下游靶基因ABCA1和SMAD3的表达而促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡[12-13]。经starBase数据库预测，circMICRA与miR-150-5p有结合位点，细胞系实验进一步证实miR-150-5p是circMICRA的直接靶标[14]。而miR-150能促进内皮细胞增殖和迁移，抑制心肌梗死后血管重构，进而参与CAD的发展[15]。此外，circMICRA还具有转录翻译成蛋白质的功能，并在肌细胞增殖过程中发挥重要作用[16]。综上所述，环状RNA circMICRA可通过调节多种miRNAs及其下游靶基因的表达参与CAD的发生发展。

Spearman相关分析显示，circMICRA表达水平与高血压呈负相关。线性回归模型校正年龄、BMI、吸烟率、饮酒率、糖尿病患病率和高脂血症患病率后，circMICRA表达水平仍与高血压患病率呈负相关。LIU等[11]研究也发现，与健康对照者相比，高血压患者外周血中circMICRA表达水平显著降低，而miR-615-5p表达水平上调。高血压会导致内皮细胞损伤和凋亡，是CAD的传统危险因素。环状RNA circMICRA表达下调可能是高血压的一种代偿性反应，能保护内皮细胞免受压力，有助于缺血性疾病的血管再生。本研究发现，circMICRA表达水平与系统性炎症指数NLR和PLR也呈负相关，提示circMICRA可能作为炎症相关因子参与动脉粥样硬化的发生、发展过程。LIANG等[17]研究也发现，circMICRA表达水平与MLR、NLR和PLR呈负相关，与本研究结果一致。MLR和NLR是心血管疾病的独立预测因素，而且与冠状动脉损伤的程度和严重程度呈正相关[18]。PLR增高是慢性炎症的标志，也是CAD发生的危险因素[19]。据报道，NLR和PLR与炎症指标IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和C反应蛋白(CRP)呈正相关，而circMICRA表达水平与这些炎症指标呈负相关，即circMICRA表达能降低促炎因子(IL-6、TNF-α)表达，增加抗炎因子(IL-10)表达，表明circMICRA在CAD炎性反应中起保护作用[17]。circMICRA还可通过抑制miR-22-3p活性，调节IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子蛋白水平，进而影响CAD的病理过程[20]。Spearman相关分析显示，circMICRA表达水平与吸烟呈负相关。在校正年龄、BMI水平、饮酒率、高血压患病率、糖尿病患病率和高脂血症患病率后，circMICRA表达水平与吸烟则无相关性。这可能是由于纳入的样本量过少导致的基本资料偏倚。但是在校正吸烟率前后，circMICRA表达均能降低CAD发病风险，说明吸烟率差异并没有影响本研究的结果。

血糖、血脂、血压受生理性因素和药物因素等影响较大，不能反映机体真实的代谢水平，所以本文选用是否具有相关病史作为分析校正因素，有待进一步研究证明。本研究仍有不足之处：(1)研究人群样本量太少，需要增加样本量来验证本研究得出的结果。(2)由于样本的限制，本文并未检测冠状动脉粥样斑块中circMICRA表达水平。(3)因最终符合纳入标准并具有完整临床资料的女性CAD患者较少，本文纳入的全是男性CAD患者，可能存在性别偏倚。

综上所述，circMICRA表达水平在CAD患者外周血中显著降低，而且与冠状动脉粥样硬化严重程度呈负相关，可能作为一种保护性因素通过炎症途径参与CAD的病理过程。