外周血巨噬细胞移动抑制因子、人类白细胞DR 抗原表达对自身免疫性卵巢早衰的诊断价值

王 群 罗明艳

1.成都市新都区中医医院妇科，四川成都 610000；2.西部战区总医院妇产科，四川成都 610000

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）指40 岁以前出现的卵巢功能衰竭，POF 患者同正常绝经期女性一样可伴围绝经综合征，严重影响患者身心健康[1-2]。自身免疫性卵巢早衰（autoimmune premature ovarian failure，APOF）指免疫因素导致的POF，占POF 的20%～30%[3]。目前诊断APOF 主要依靠卵巢穿刺活检，但该方法有创且不能完全反映卵巢状态。巨噬细胞移动抑制因子（migration inhibitory factor，MIF）是一种多嗜性炎症细胞因子，在先天免疫和适应性免疫中具有上游调节作用，参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、腮腺炎等自身免疫性疾病的发病机制[4-6]。人类白细胞DR 抗原（human leukocyte antigen DR，HLA-DR）是免疫细胞活化敏感指标，参与自身免疫性疾病的发病和进展[7]。MIF、HLA-DR 是否参与APOF 发病尚不清楚，本研究检测POF 患者外周血MIF、HLA-DR 表达，探讨其在APOF 中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年6 月至2020 年6 月成都市新都区中医医院（以下简称“我院”）收治的124 例POF 患者，纳入标准[8]：①年龄＜40 岁，闭经3 个周期或6 个月以上；②促卵泡激素＞40 U/L，雌二醇（estradiol，E2）≤50 pg/ml；③超声提示无卵泡、子宫小。排除标准：①多囊卵巢综合征；②卵巢或子宫切除；③近期服用免疫抑制剂，激素类药物。APOF 诊断标准：在POF 诊断基础上需满足抗卵巢抗体（antiovary antibody，AOAb）、抗透明带抗体（anti zona pellucida antibody，AZpAb）、抗核抗体（antinuclear antibodies，ANA）等至少一项抗体阳性[9]；病理学发现卵巢细胞减少，浆细胞、淋巴细胞浸润。根据APOF 诊断标准将患者分为APOF 组（45 例），NAPOF 组（79 例），另选择同期我院妇产科门诊体检的60 名健康女性为对照组。本研究经我院医学伦理会批准，所有受试者均知情同意并签署同意书。

1.2 检测方法

患者入院次日清晨（体检者体检当日清晨）采集空腹静脉血6 ml 分别注入干燥试管和肝素抗凝管，干燥试管标本离心（3000 r/min，离心时间15 min，离心半径10 cm）后取血清-80℃保存待检。酶联免疫吸附试验检测MIF、促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、E2水平，仪器为Elx800 酶标仪（美国BioTek 公司），试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗公司（MIF、LH、FSH 试剂盒生产批号：180211，E2试剂盒生产批号：200511）。金标免疫斑点法测定AOAb、AZpAb、ANA，抗体购自美国Santa 公司（AOAb、AZpAb 生产批号：180912，ANA 生产批号：191003）。

肝素抗凝管标本充分混匀后制备淋巴细胞悬液，采用EPICS-XL 流式细胞仪检测，免疫双荧光法检测HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+占淋巴细胞的百分比，试剂为异硫氰酸荧光素-鼠抗HLA-DR 单克隆IgG 抗体。抗体购自美国Santa 公司（生产批号：180211）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验；两组间比较采用独立样本t 检验。计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；两两比较采用Bonferroni方法校正。二元logistic 逐步回归分析APOF 发病危险因素。受试者操作特征曲线分析MIF、HLA-DR 诊断APOF 的价值。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组基线资料及MIF、HLA-DR 比较

APOF 组AOAb、AZpAb、ANA 阳性占比及MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+水平高于NAPOF 组和对照组，差异均有统计学意义（均P ＜0.05）；NAPOF组MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+水平高于对照组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。APOF 组、NAPOF 组孕次、E2水平低于对照组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；月经初潮年龄及血清LH、FSH 水平高于对照组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。APOF 组合并自身免疫性疾病占比高于NAPOF 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 三组基线资料及MIF、HLA-DR 比较

2.2 不同病情APOF 患者MIF、HLA-DR 水平比较

合并自身免疫性疾病、AOAb 阳性、AZpAb 阳性、ANA 阳 性APOF 患 者MIF、HLA-DR+CD3+、HLADR+CD19+水平高于未合并自身免疫性疾病、AOAb阴性、AZpAb 阴性、ANA 阴性患者，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 不同病情APOF 患者MIF、HLA-DR 水平比较（）

表2 不同病情APOF 患者MIF、HLA-DR 水平比较（）

注：与未合并自身免疫性疾病/AOAb/AZpAb/ANA 阴性比较，aP ＜0.05。APOF：自身免疫性卵巢早衰；AOAb：抗卵巢抗体；AZpAb：抗透明带抗体；ANA：抗核抗体；MIF：巨噬细胞移动抑制因子；HLA-DR：人类白细胞DR 抗原

2.3 APOF 发病的影响因素分析

124 例POF 患者以是否发生APOF 为因变量（赋值：0=否，1=是），MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+、AOAb、AZpAb、ANA（均为连续变量原值带入），合并自身免疫性疾病（赋值：0=否，1=是）为自变量，建立logistic 回归方程，逐步法排除无关变量。结果显示合并自身免疫性疾病，高MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+水平是APOF 发病的危险因素（OR ＞1，P ＜0.05）。见表3。

表3 APOF 发病的影响因素分析

2.4 MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+诊断APOF效能分析

联合MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+诊断APOF 的曲线下面积高于单独MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+诊断（Z=3.261、2.956、3.512，P ＜0.05）。见表4、图1。

图1 MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+诊断APOF 受试者操作特征曲线

表4 MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+诊断APOF 效能分析

3 讨论

POF 是多种病因导致的卵巢功能早衰，自身免疫系统紊乱是主要原因之一，以卵巢相关自身抗体出现，卵巢淋巴细胞性浸润，合并其他自身免疫性疾病为特征。目前临床缺乏敏感性和特异性高的生物学指标，因此探讨与APOF 免疫功能紊乱的生物学指标具有重要意义[10]。

MIF 是由活化T 淋巴细胞分泌的多功能细胞因子，具有抑制P53 介导的细胞凋亡，抑制糖皮质激素效应，参与固有和适应性免疫、自身免疫疾病、炎症反应等病理生理过程[11-13]。既往研究显示MIF 在白癜风[14]、类风湿关节炎[15]中水平升高，与病情和进展均有关。本研究结果显示，高MIF 水平是APOF 发病的危险因素之一，MIF 参与了APOF 发病机制。APOF 患者多伴自身免疫疾病以及多种自身免疫抗体，高浓度抗体可引起和加重卵巢功能衰退[16-17]。本研究结果显示，在合并自身免疫疾病、AOAb、AZpAb、ANA 抗体阳性表达者中MIF 水平高（P ＜0.05），提示MIF 参与APOF 自身免疫系统紊乱。可能的机制为MIF 增加巨噬细胞吞噬作用影响固有免疫，MIF 作为初始炎症因子促使白细胞介素-2、白细胞介素-6、白细胞介素-8、前列环素等炎症因子释放，放大炎症反应，加重APOF 自身免疫系统紊乱。

HLA-DR 是HLA 的Ⅱ类抗原，主要定位于巨噬细胞和B 淋巴细胞表面，通过结合提呈抗原肽，活化T 细胞，启动免疫应答，是免疫细胞活化指标[18-19]。研究显示，多发性硬化症[20]、类风湿关节炎[21]患者外周血单核细胞HLA-DR 均呈高表达，可为类风湿关节炎早期诊断提供参考[22]。本研究结果显示，HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+与APOF 发病有关。分析原因为机体炎症性反应刺激肿瘤坏死因子、γ 干扰素、白细胞介素等炎症细胞因子合成和释放，诱导CD3+、CD19+细胞表达HLA-DR，HLA-DR 高度表达导致T细胞过度活化，加重免疫系统紊乱，引发APOF。Li 等[23]研究显示，HLA-DR 可诱导特异性T 细胞反应，参与自身免疫性甲状腺炎的发病过程。本研究结果显示，HLA-DR 表达与APOF 合并自身免疫性疾病、AOAb、AZpAb、ANA 抗体表达存在一定关系，可能是因为HLA-DR 过表达激活自身抗体表达，导致自身免疫疾病发病。系统性红斑狼疮相关自身抗体的产生也被证明是T 细胞依赖和HLA-DR 限制抗原驱动所致[24]。

受试者操作特征曲线结果显示，MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+联合可提高APOF的诊断效能，提示MIF、HLA-DR 均上调可能意味着患者APOF发病风险更大。本研究结果显示，合并自身免疫性疾病与APOF 发病有关，相关报道指出APOF 患者多合并类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病[25-26]，红斑狼疮患者体内激素水平紊乱，也可导致卵巢功能早衰[26]。

综上所述，APOF 患者MIF、HLA-DR+CD3+、HLADR+CD19+水平升高，高MIF、HLA-DR+CD3+、HLADR+CD19+水平是APOF 发病的危险因素。联合MIF、HLA-DR+CD3+、HLA-DR+CD19+可为APOF 诊断提供有效参考。